Bonjour tout le monde,
J'aimerais tester l'activité d'une enzyme ainsi que quantifier le "nombre" de substrats transformé pour le comparer à d'autres conditions expérimentales (et voir en gros, dans quels conditions l'enzyme fonctionne "à plein régime").
Avez vous une idée des techniques à employer (au moins leurs noms...) que je puisse effectuer des recherches plus efficaces svp?
Merci!
Personne n'a d'idée?
il y a plein de techniques différentes,mais tt dépend de l'enzyme, du substrat et du milieu...
spectrophotomètre, électrode à membrane souple enzymatique,..
Merci bcp Squalor pour la réponse.
J'aimerais tester l'activité de certains enzymes du métabolisme du glucose telles la PFK1 ou encore la pyruvate deshydrogenase... mais leur produit n'est pas du H202 ni du NADH pour visualiser au spectophotomètre...
Pourquoi parles-tu de milieu?
L'electrode à membrane souple enzymatique, kesako?
Je parle du milieu, pour qu'il n'interfère pas avec ton dosage.
Les électrodes à membranes souples (enzymatique) est formée dans ton cas d'une électrode sélective (ici à membrane souple, mais je pense qu'il existe aussi à membrane solide), entourée d'1 film poreux dans lequel on immobilise le substrat.
=> on teste ainsi l'activité enzymatique (c'est ce que tu veux je crois)
J'ajoute qu'il me semble que la pyruvate deshydrogenase produit du NADH + H+ et donc en regardant une variation de pH il y aurait peut etre moyen de voir quelques chose ( mais je peux me tromper...)
bien à toi,
Greg
un petit lien comme exemple:
http://docinsa.insa-lyon.fr/these/20...teau/these.pdf
Tu peux essayer de réaliser une colonne enzymatique en incluant ton enzyme dans un résine et tester différents tampons, et entre chaque tampon il va falloir que tu laves avec un tampon de référence pour mesurer une activité de référence car certains tampons testés pourraient dénaturer ton enzyme.Envoyé par Abricote
Si ce n'est pas clair je peux tenter une explication plus structurée...
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
Au temps pour moi Greg, le test d'activité de la pyruvate deshydrogenase est effectivement simple; il va falloir mtn que je trouve pour la PFK1 et le glucose 6 phosphate deshydrogenase.
Par contre, j'ai lu lors de mes recherches que le test de pH est peu fiable et que mieux vaut mesurer l'apparition de NADH...
Pour la PFK, tout ce que j'ai trouvé est de mesurer la disparition de NADH en couplant l'enzyme à l'aldolase, la glycerophosphate deshydrogenase (pquoi celle ci, jl'ai pas compris..) et la triose phosphate isomerase...
Pour ce qui est du milieu, j'veux essayer en conditions normoglycémique et hyperglycémique, c'est tout.
En tt cas, merci bcp pour ta réponse.
Euh... désolée mais j'ai pas compris
Disons que tu disposes de ton enzyme en solution.
Euh... désolée mais j'ai pas compris
On va chercher à l'inclure dans une résine que l'on va effectuer soi-même, avec la plus petite taille de grain possible.
Pour cela on va chauffer l'enzyme en la mélangeant à une résine qui se liquéfie à une température de 40-42°, on applique le mélange dans une burette chaude et on fait goutter la burette dans le tampon initial de l'enzyme (Tris par exemple) à tempréature ambiante ou même plus froid : les gouttes venant de la burette vont se figer quasi-instantannément. Pour avoir une bonne forme quasi-sphérique des grains, il faut agiter en continu le contenu du réceptacle.
Ainsi on va avoir un tas de petites billes contenant l'enzyme, une partie de l'enzyme étant en surface.
Ensuite, on va pouvoir déposer cette résine dans une colonne dont la sortie est protégée par un tampon (coton fritté, des trucs comme ça...), que l'on va équilibrer avec le tampon de l'enzyme (Tris en gardant le même exemple).
En mettant différants substrats potentiels qu'on laissera apsser dans la colonne, on va pouvoir caractériser l'efficacité de l'enzyme à transformer ces substrats en dosant le produit dans le liquide recueilli en bas de colonne.
Il erste à adapter un protocole expérimetal
Jean-Luc
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Salvor Hardin
