Connaitre séquence génomique....

[peptofr]

Bonjour à tous,

J'ai un petit problème à vous soumettre. Je travaille actuellement sur un organisme animal sur le quel il n'existe pas (ou peu...) de séquences connues, ni banque de BAC etc...
J'ai reussi à amplifier par PCR un fragment du génome de 700pb que j'ai fait séquencé. Je souhaiterais à présent connaitre la séquence génomique qu'il y a avant et aprés (disons 5Kb avant et 5Kb aprés).
Mais je bloque, j'ai contacté une entreprise qui fait du séquençage en routine et ils me disent qu'il ne peuvent pas faire une telle prestation directement sur génomique....que faire ??

Avez vous quelque chose pour me faire avancer ??

Merci
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[piwi]

Ce que je vais te proposer est peut être un peu n'importe quoi mais ca peut être un début de discussion.

Ton problème c'est que tu ne sais pas comment isoler ta séquence. Cependant tu as un début vu que tu as pu faire une PCR.
Voilà mon idée.

digestion de restriction avec plusieurs enzymes dont les séquences ne reviennent pas trop souvent (digestions simples et doubles histoire d'avoir les fragments avec plusieurs origines et fins différentes.). Tu as une idée de la complexité du génome? (tu peux faire des essais pour voir la taille moyenne des fragments que tu rammènes). Tu fais une banque avec tout cela.
Ensuite tu screenes ta banque avec tes oligos de PCR (colony lift).
Tu repiques les clones positifs et tu fais une PCR pour voir si ce sont bien des vrais positifs et verifier que le fragment correspond.
Enfin, pour ceux que collent tu amplifies et tu fais séquencer avec tes oligos.
Soit tu as tout de suite de la chance et tu as ce que tu veux soit tu avance un peu mais pas assez. Dans ce cas tu réécris de nouveau oligos à partir de ce que tu as révélé et tu rescreenes ta banque avec. Tu devrais pouvoir avancer de proche en proche.

Voilà, avec cette technique j'imagine que l'on peut faire quelque chose mais j'ai l'impression que ca va prendre un peu de temps.

Je vais peut être réfléchir à une optimisation au cas où personne ne viendrait mieux que moi à ton secours.

Cordialement,
piwi

[wishangel]

Salut a toi,

je peux te conseiller le genome walking. C'est une technique qui permet d'analyser des fragments adjacent de proche en proche. La premiere étapes consiste a construire une banque de fragment tagé. Et apres y a une PCR et une nested a faire, avec une amorce spé de ta sequence connu et une amorce spé du tag. Perso j'ai utilisé le kit de chez BD biosciences...

[Yoyo]

Salut

Une technique "classique" quelquepeu differente de celle proposée par PIWI.
Tu fait ton extraction d'ADNg que tu digeres séparément par différentes enzymes qui ne coupent pas dans les 700nt que tu connais deja.
Ensuite tu utilises la T4 DNA ligase pour religuer tous les fragments sur eux-meme.
Ensuite tu prends des oligos qui se trouvent a chacune des extremités du fragment connu, mais qui sont orientés vers l'exterieur du fragment.
Et tu fais une PCR sur tout tes produits de ligation. Normalement tu vas donc amplifier les régions flanquantes du fragment deja connu. Il ne te reste plus qu'a séquencer ces prodtuis de PCR identifier le site de coupure pour trouver la delimitation et le tour est joué

Bref, une extraction, une digestion, une PCR, un sequencage et le tour est joué! bref 3 jours de boulot...qui dit mieux

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[peptofr]

Merci à tous pour vos réponse et également à celles qui vont venir.

Pour ce qui est de faire une banque moléculaire.... hum hum ... comment dire, c'est je pense un gros boulot... et avec quelle garantie pour quelqu'un qui n'a jamais fait cela ?? Et la sous traitance doit être chère ... et dans combien de temps??? Bref, ce n'est pas quelque chose d'envisageable pour moi.

La solution de YoYo m'a l'air très intéressante. Avez vous des publis ou de la documentation ou même un protocole décrivant cette technique ? Y a t il un nom anglais qui faciliterais mes recherche ? Je ne trouve rien pour le moment...

Cette solution est elle faisable ? Sur le papier elle est très attirant en effet, mais la ligase n'a t elle pas trop beaucoup de boulot ? Si quelqu'un a fait cela avec succès je veux bien qu'il se manifeste !!! Pour augmenter les chances de succés, il faudrait mieux le faire avec une plusieurs enzymes de restrictions !! Merci yoyo !!

De mon coté, je réfléchissais à faire une chromatographie d'affinité sur ADN g digéré avec des primers spécifiques de la séquence connues et cloner ce qu'il en sort (voir meme traiter l'eluat avec la technique de yoyo). Savez vous si de tels kits existent ?? Je dois pas etre bon en recherche sur le web.... mais je poursuit et je vous tien au courant.

Encore merci

[piwi]

Bref, une extraction, une digestion, une PCR, un sequencage et le tour est joué! bref 3 jours de boulot...qui dit mieux

J'aime quand ca a l'air si simple!
En tout cas c'est plus simple que ce que j'avais imaginé. Reste que à 5kb avant et 5 kb après, Ca fait pas mal en une seule PCR, même en long range (surtout si on veut séquencer derrière). Ca n'évitera pas de devoir redéfinir de nouveau oligos pour avancer de proche en proche.

Cordialement,
piwi

[wishangel]

Snif, a priori ma proposition n'a pas convaincu... Je voudrai juste rajouter que c'est vraiment pas bcp de boulot. Pour le genome walking tout est fourni dans le kit : enzyme de digestion, ligase pour le tag, temoin...
Sinon effectivement en une fois ca risque de faire un peu juste...

[peptofr]

Non, non wishangle, pas de sniff!!!!

Ce que je disais à propos des banques, c'est qu'il doit être long de faire une banque avec des vecteurs plasmides, BAC ou autre, car il faut construire la banque voir les taux de recouvrement, plater, transformer, screener...etc... y 'a toute une gestion derriere.

Ce qui me plait dans la methode de yoyo c'est que c'est une methode directe, mais en fin de compte, c'est égaleemnt du screening de banque que l'on pourrait qualifier de temporaire !!

Pour en revenir au kit, de BD science tu me donner les references du kit en question. Je ne le trouve pas sur le site ??

Merci

[peptofr]

Oui, Piwi et les autres, mais ce n'est pas un problème si il faut le faire en plusieurs fois. Ce qui est bien c'est que en 3 - 4 jours, j'ai les premiers réusltats, un "proof of concept"... il n'y aura donc aucun probleme à refaire un ou plusieurs tours...

Par contre n'y a t il pas de probleme à faire les ligations sur autant de framgents ??

Bon je crois que pour avancer au plus vite, je vais commander des oligos !!

Merci

[gorben]

Salut,

La methode de Yoyo est tres bien, tres rapide et "tres facile".

Tu peux aussi utiliser une amorce fwd dans tes 700 pb connues puis une deuxieme amorce degeneree (avec une partie connue pour faire une pcr nichee par la suite) pour ta PCR.
Tu amplifies ton ADNg une premiere fois, puis tu refais une pcr nichee sur ton produit pcr en utilisant l'oligo specifique de ton fragment d'ADN + l'oligo specifique de ton oligo degenere... Je ne sais pas si je suis tres clair... Un labo voisin de mon labo de these utilisait cette methode pour sequencer de l'ADN inconnu. C'est plutot facile, mais tu n'as que des fragments courts a chaque fois (max 500 pb)

A+

[wishangel]

En fait c'etait chez BD Clontech mais a priori ils ont pris des routes séparé.
J'ai donc trouvé sur le site de Clontech. Mais il y a peu etre d'autre fournisseur

http://www.clontech.com/products/det...=10396&tabno=2

[Yoyo]

salut

moi je me suis servi de cette technique quand je travaillais sur un organisme dont le génome n'etait pas connu. Ca marche bien, l'interet d'utiliser plusieurs enzyme de digestion c'est que justement tu as des fragmentsde taille variables. Si ton genome est GC riche, alors prends des enzymes qui coupent plutot des sites AT riche (ils seront plus rares!).
La ligation ne pose pas de probleme mais il faut surtout bien diluer tes fragments digérés avant la ligation, sinon il y a un risque qu'il se liguent entre eux! ce que tu ne veux pas.

apres il te faudra sans doute optimiser les conditions de PCR, et notamment le choix de la taq (long-range ou pas)

tiens nous au courant.

YOyo

[invitee8b3f97e]

Salut !

Pour la PCR inverse, il peut être intéressant d'utiliser une 2eme enzyme de restriction située entre les 2 amorces, de manière à relinéariser le brin d'ADN circulaire. Cela facilite la PCR sur des petits fragments.

[cysto]

Bonjour ,pour ne pas recréer un nouveau topic, je poste ici, je voudrai savoir pourquoi on fait un clonage (fragmentation du génome, et incorporation des fragments dans un vecteur et établissement d'une banque génomique ...) pour faire un séquençage ?!!!!
Aussi, j'arrive pas à percevoir cette technique ! corrigez moi si je me trompe:
Dans chaque tube à essai, on met en présence de l'ADN, l'enzyme, l'amorce, tp et Mg2+ , dNTP....les ddNTP !!! et donc dans chaque tube, par exemple le tube A: dés qu'on trouve la base A ça s'arrête !!! donc on est censé trouvé dans notre tube deux fragments ??? puisqu'il est coupé au niveau de la base A !!! On fait quoi de l'autre fragment ???!!! je veux dire que celui qui nous interesse est celui qui se termine par la base A et l'autre alors ???!!!!!
Voilà priére de répondre à mes deux questions, je suis paumée !!! merciii