Problème PCR : Besoin d'aide

[invite6c99c631]

Bonjour, excusez moi de vous déranger,

Je suis étudiant et actuellement en stage dans un laboratoire. J’ai un soucis en PCR qui m’empèche d’avancer dans mon travail. Nous avons réfléchi mais ne voyons pas d’où peut venir le problème alors, nous nous en remetons à vous.

Je travaille sur la maladie de la langue bleue. Je fais une PCR en temps réel sur l’ARN viral (BTV : BlueTongue Virus)

1) Je fais une extraction d’ARN (par la méthode Trizol/chloroform)
2) Je procède à une Transcription Inverse sur cet ARN afin d’obtenir de l’ADNc que
3) j’utilise dans une PCR en temps réel

C’est dans cette troisième étape que mon problème se situe. J’ai déjà fait une quinzaine de fois l’expérience (qui demande près de 8h de temps) et le problème persiste…

Pour ma PCR, j’utilise d’un coté :

2 Primers + 1 sonde spécifiques à BTV
(la sonde fluorescente est composée du fluorochrome FAM et du Quencher BHQ1)

et de l’autre :

2 Primers + 1 sonde spécifiques à la Béta actine
(la sonde fluorescente est composée du fluorochrome FAM et du Quencher BHQ1) soit exactement la même chose que pour BTV

Et pourtant les courbes obtenues lors de la PCR en temps réel sont considérablement différentes.

Voici le genre de graphique que j’obtient :

nb : nous avons demandé au fabriquant d’où pouvait venir le problème, qui nous a renvoyé un nouvel échantillon de sonde… mais le problème n’a pas été résolu.

Merci pour votre attention j’espère que vous pourrez m’aider.

J'ai placé l'image en pièce jointe (c'est la solution à préférer) et je déplace vers le forum de biologie.

JPL, modérateur
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[LXR]

La plupart du temps quand on obtient ce genre de courbe en qPCR, c'est que les sondes utilisées ne sont pas assez spécifique ou que le gène regardé n'est pas assez exprimé. Tu regarde la b-actine, donc le problème ne vient pas de là pour ce gène car il est bien exprimé chez tous les types cellulaires. Donc la première possibilité est la plus probable.

Est-ce que c'est toi qui a fait le design d'amorces ou est-ce que c'est une société qui vous les fournit automatiquement ? Car si tu as un programme du style Beacon pour faire ce design, je te conseille de l'utiliser car il est vraiment très fiable, en tout cas pour la méthode au SyBRGreen.Je n'ai jamais utilisé la technique Taqman, mais d'autres personnes qui travaillaient pourtant sur le même thermocycleur que moi, l'ont utilisé et elles semblaient avoir quelques problèmes....Cette technique est donc peut-être moins fiable que celle du SyBRGreen.

Greg

[invite6c99c631]

J'ai envoyé mes séquences à une firme en précisant les fluorochrome et quencher. et ils me l'ont donc envoyé.

pour BTV:
GGCAACYACCAAACATGGA BTV_S5_F_1-19
AAAGTYCTCGTGGCATTWGC BTV_S5_R_76-57
FAM-CYCCACTGATRTTGTATTTTCTCAA-BHQ1 BTV_S5_P_49-27

pour B-act
CAGCACAATGAAGATCAAGATCATC ACT_F_1005-1029
CGGACTCATCGTACTCCTGCTT ACT_R_1135-1114
FAM-TCGCTGTCCACCTTCCAGCAGATGT -BHQ1 ACT_P_1081-1105

voilà
j'ai vérifié la spécificité.
il y'a aussi des bases dégénérée, comme "Y". C'est du au fait qu'il y a 24 sérotypes différents au virus. Et cette PCR permet de détecter les 24...

je vais essayer demain ou vendredi le SyBRGreen. c'était prévu! on verra ce que ca donne...

J'aifait aussi une pcr classique, et j'ai mis sur gel avec Bromure d'éthydium
quand j'utilise l'ARN synthétique que l'on ma fourni comme Témoin Positif, j'ai une bande, mais quand j'utilise mes échantillons de terrains, je n'ia pas de bande... mais je ne l'ai encore fait que sur un seul échantillon... je vais réessayer. merci beaucoup en tout cas.

[Squalor]

Salut!

Petites question au sujet de tes primers (attention, la viro et moi... ca fait 40 )
L'ARN dont tu fais la RT-PCR est il d'origine Viral ou de l'hôte?

Si c'est de l'hôte, estce que tu utilises bien des primers pour l'organisme cible considéré (souris, lapin,...)?

As tu fais un BLAST de tes séquences?

as tu vérifier les ARN sur un gel avant de faire la RT reaction?

Je suppose que dans ton RT reaction tu utilises des Randoms Primers, as tu vérifié la qualité, concentration de ce produit (j'ai eu pas mal de problèmes avec ca il y a une semaine et la solution était que ma concentration était tout simplement trop faible...)

La dernière: je suppose que ton master mix de Rt reaction et PCR est commun as tous les échantillons... (mais on ne sait jamais)

enfin, voila j'ai pas d'autres idées de sources de problèmes pour l'instant...


amicalement,

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6c99c631]

1) Je fais une extraction d'ARN (trizol chloroform) sur échantillon de sang (bovin ou ovin). J'extrais donc l'ARN de l'hôte + l'ARN viral (s'il est présent).
Et donc c'est l'ARN viral que j'essaie de mettre en évidence par ma PCR

2) Oui j'ai vérifié mes séquences avec BLAST

3) Comment vérifie-t'on les ARN sur Gel?

4) Dans mon mix RT, j'utilise des Random Hexamers oui... (je vais creuser ca...)

5) et enfin, oui mon mix est le meme pour les 2 cas.

voilà, en tout cas, merci pour vos réponses déjà.

[Squalor]

Yop!

Dans mon labo, on fait toujours un gel petit gel de controle , pour regarder la qualite des ARN.

donc on fait un Gel 1,5 % d'agarrose TAE ou on load 2 micro grammes de chaque ARN. le tout est revele par du bromure d'ethydium

(donc il ne s'agit en rien d'un Gel super top, denaturant, etc... c'est juste pour faire un controle qualite rapide pour savoir s'il y a des degradations ou pas, ce genre de chose...)

tu y verras les bandes classiques 5S 18S et 28S (vu que tu fais une extraction total, il me semble)

amicalement,

Greg

[invite6c99c631]

Je vais faire

1) Migrer mes Produits de PCR sur gel 3% (vu la petite taille des fragments amplifié (entre 70 et 80 pb) ) et voir si j'obtient une bande dans cet ordre de grandeur.

2) Faire une PCR sur plusieurs fois le même échantillon mais avec un gradien de température au niveau de la t° d'hybridation de façon à peut être optimiser celle ci (c'est en effet l'étape là plus critique de la PCR)

3) essayer avec SyBRGreen et voir s'il on a une amélioration.

4) jouer sur la concentration en amorces.

si vous avez d'autres idées, merci beaucoup Aux Greg(s)

[MaliciaR]

Salut,

Je me joins à LXR pour le conseil d'utiliser SyBR-Green. Il m'est arrivé un truc bizarre quand je travaillais sur le virus de la Dengue et celui de la Vallée du Rift en utilisant d'autres qPCR : j'avais l'impression de détecter des quantités correspondant uniquement au bruit de fond... Bref, avec la SyBR-Green tout est rentré dans l'ordre.
Et pourquoi ne pas essayer d'abord de faire une qPCR avec des concentrations connues de ton ADN? Si tu fais plusieurs dilutions successives et une qPCR dessus, tu verras le résultat.
Je ne suis pas sûre que la remarque suivante sera très pertinente dans ton cas mais bon... Tu pars d'échantillons totaux si j'ai bien compris. Dans mon cas, je partais de sang total et je me suis rendue compte que les ARN eucaryotes gênaient pour la suite : soit l'étape de synthèse de l'ADNc déconnait et je me retrouvais avec rien du tout en qPCR, soit la qPCR elle-même crashait pour je ne sais quelle raison... Je crois que ce serait dû à la protéinase K dans certains cas, à la petite quantité d'ARN viraux dans un autre (plutôt la très grosse quantité d'ARN eucaryote gêne...).

J'espère que ça ira pour ta qPCR
Cordialement,

[chahinez23]

Bonjour, SVP j'ai fait ce matin une PCR Taqman sur une plaque à 48 puits avc un assay dattant de 2ans au congélo sachant que ça a déja marché y a qq mois sur d'autres ADNs et pareil pr le master-mix for genotyping et le prblm c que j'ai eu des résultats vraiment bizarres ç à d: des courbes qui montent et d'autres qui descendent et tout au long du temps pas juste au moment du CT !!!! Comment pouvez vous m'expliquer ça !

[chopinbiologiste]

j'ai un problème avec ma qrtpcr

il y a eu detection et je visualise une belle courbe mais ce n'est pas reproductible avec le même échantillon. WHY,?,,,,,?

MERCIIIIIIIIIIIIIII