Cycle cellulaire

[invitee93ed335]

bonjour a tous
je veux seulement savoir quelques methodes utilisées pour l'etude du cycle cellulaire.
merci
-----

[invite7ebb6db4]

Moi je veux bien t aidé mais tu veux étudier quoi dans le cycle cellulaire.
Pourcentage de cellule en phase S, M, G1, G2?
Passage du point R?
...

[invite689529bc]

bonjour a tous
je veux seulement savoir quelques methodes utilisées pour l'etude du cycle cellulaire.
merci

salut,

Je suis pas certaines de comprendre ta question. Est-ce que tu veux savoir si le cycle cellulaire est modifié/altéré ? tu veux savoir comment on peut apprendre ça et avec quelle techniques ?
Si c'est ça, alors il existe plusieurs façon d'avoir accés au cycle cellulaire et àa son activité dans une cellule. Tu peux analyser l'expression de certaines cyclines et des cdk, en faisant un Q-PCR par exemple. Tu pourrais analyser l'expression de certaines protéines connues pour leur implication à différentes étape du cycle (lors de la réparation par exemple): ATM, ATR, Rad51...
Tu pourrais aussi utiliser des drogues pour réprimer ou favoriser l'entrée en cycle des cellules, en fait tout dépend de ce que tu veux voir. Si ça ne répond pas vraiment à ta question, tu peux préciser plus avant.

Voilà,
belouga7

[inviteca614eab]

Salut,

La méthode la plus utilisée est l'analyse par cytométrie de flux (FACS). On récupère les cellules traitées ou non par les molécules étudiées. Je te passe les détails, mais le principe et de marquer l'ADN par un agent fluorescent (en général l'iodure de propidium). Le FACS va prélever les cellules et donner un profil de fluorescence pour les cellules analysées: une valeur a (cellules en GO/G1), a+b (b<a) pour la phase S et 2a (pour G2/M). Si tu as de la cytotoxicité avec découpage d'ADN (apoptose par exemple), tu as une pre G1 (valeur c<a). En traitant les données, tu as accés au % des cellules dans les phases du cycle cellulaire. Tu peux alors conclure sur l'activité de ta molécule (antimitotique avec blocage en G2/M) puis orienter la suite de ton étude en foction de ça (microtubules ou cycline etc).

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee93ed335]

bonjour
desolé pour ce retard.
moi ce que je veux savoir c toutes les methodes qu'on peux utiliser pour etudier un cycle cellulaire d'une cellule dés la transition G0/G1 jusqu'a avoir 2 cellules filles en passant par les defferantes etapes connues du cycle.
merci

[invite7eb2285b]

Bonjour djabioch,

Ta question est un peu vague, surtout que je ne connais pas ton niveau, mais je vais essayer de te donner quelques pistes avec les quelques connaissances que j'ai.

Tout d'abord, tu peux utiliser plusieurs types de matériel biologique pour réaliser ton étude. Notamment, les ovocytes de xénope qui présentent l'avantage d'être de grosses cellules (donc de posséder beaucoup de matériel) et qui sont naturellement bloquées aux transitions G2-M et métaphase-anaphase. La maturation des ovocytes peut être observées sous une loupe binoculaire de par l'apparition d'une tâche de dépigmentation témoin de la remontée de la vésicule germinative au pôle animal après traitement à la progestérone. Tu peux aussi utiliser des cellules synchrones que tu peux traiter ou non à l'aide de certaines drogues comme l'a indiqué belouga7.

Au niveau des manipulations tu peux réaliser un western blot à partir de tes différentes cellules lysées ciblant certaines protéines spécifiques du cycle cellulaire.
Tu peux également fixer tes cellules et réaliser une immunofluorescence à l'aide d'Ac anti-tubuline ou anti-microtubules par exemple et faire sur ces même lames une coloration de l'ADN àl'Iodure de Propidium. De cette manière tu pourras observer l'organisation du cytosquelette au cours des différentes phases et la condensation de l'ADN ainsi que sa migration au niveau de la plaque équatoriale et sa séparation entre les 2 cellules filles.
Un FACs comme l'a indiqué léo2 est également un très bon moyen d'étude.

Voilà quelques pistes. Il existe sûrement beaucoup d'autres méthodes mais là je laisse libre cours à ton imagination...

Joyeux noël.

[invite92cd8f8c]

Je vais moi aussi en donner quelques unes, mais c'est assez basique (j'ai appris qu'on pouvait utiliser la cytomètrie de flux quelques lignes plus haut!).


Comme l'a dit Pseudomonas, on peut utiliser des ovocytes de Xénope, dont l'étude est aisée en raison de leur taille; on peut aussi utiliser des ovocytes d'invertébrés (oursin, étoile de mer, etc...) car ils sont transparents, on peut ainsi observer des phénomènes comme la condensation des chromosomes ou la destruction du noyau.

L'effet du MPF sur La transition G2-M peut être étudié par incubation des ovocytes dans du MPF ou dans des inhibiteurs, ou encore en détruisant l'ARNm de la cycline B.
On regarde ensuite si il y a maturation (apparition de la tache de dépigmentation).

Pour étudier l'effet de cycline D/cdk4 et cycline E/cdk2 sur la transition G1-S, on peut utiliser un ADNc anti-sens ou un anticorps anti-cycline D ou E pendant la phase G1.
On regarde ensuite si la phase S a lieu (réplication de l'ADN)

[invitee93ed335]

mercie pour tous les participants
parmis les methodes les plus importantes dans l'etude du cycle en trouve la cytometrie en flux qui est utilisée pour la quantification du pourcentage des cellules en phase s .comment?
d'autre part est ce qu'il existe des methodes d'etude de la transition G2/M ?
merci

[invite7eb2285b]

mercie pour tous les participants
parmis les methodes les plus importantes dans l'etude du cycle en trouve la cytometrie en flux qui est utilisée pour la quantification du pourcentage des cellules en phase s .comment?
d'autre part est ce qu'il existe des methodes d'etude de la transition G2/M ?
merci

Juste une petite précision, la cytométrie en flux porte aussi le charmant nom anglais de FACs et il me semble que léo a très bien expliqué cette méthode.

Voilà pour la petite précision.

[inviteca614eab]

L'analyse par FACS (merci pour la précision pseudomonas), te permet de quantifier le % de cellules en G0/G1, S, G2/M et pré G1 (si il y a de la tox). En fait, tu as un profil de fluorescence avec un pic G0/G1 (valeur n), une sorte de rectangle (la phase S qui s'étend de n à 2n) et le pic G2/M. Avec le logiciel, tu peut integrer l'aire et il te donne le % dans chaque phase. tu peux facilement trouver des publis sur pubmed avec du cycle cellulaire en facs (tentes cell cycle AND FACS comme mots clés). Par contre, tu ne peux pas discriminer par facs (en tout cas par cette méthode) entre GO et G1 ou entre G2 et M.

[invitee93ed335]

salut.....
j'ai trouvé une difficulté dans la comprehension de principe du FACS et surtout comment ce fait le tri cellulaire et dans l'interpretation de l'histogramme (facs): nombre de cellules = F(quantt d'ADN). aidez moi svp.
pour quoi y a une heterogeniété de repartition des cellules dans les trois phases G0/G1,S et G2/M ?
merci

[invite7eb2285b]

salut.....
j'ai trouvé une difficulté dans la comprehension de principe du FACS et surtout comment ce fait le tri cellulaire et dans l'interpretation de l'histogramme (facs): nombre de cellules = F(quantt d'ADN). aidez moi svp.
pour quoi y a une heterogeniété de repartition des cellules dans les trois phases G0/G1,S et G2/M ?
merci

Pour répondre à ta première question et en essayant de faire simple (désolée de devoir te recouper léo2). L'ADN des cellules à analyser est marqué au Iodure de Propidium (par exemple). Ces cellules passent ensuite dans une machine (). Dans cette machine, elles sont éclairées par un laser, qui va permettre d'exciter l'Iodure de Propidium qui va ainsi émettre une fluorescence. Cette fluorescence, est captée par un détecteur. Un ordinateur va permettre de la quantifier (et donc déterminer la quantité d'ADN dans chacune des cellules: plus une cellule est fluorescente, plus elle possède d'ADN et inversement). L'ordinateur va, en fonction des différents critères de taille et d'intensité de fluorescence, charger différement les cellules en leur ajoutant une charge positive ou négative ou pas de charge du tout d'ailleurs. Les cellules passent ensuite entre des électrodes. Les cellules chargées positivement vont être attirées par le pôle moins et donc être déviées vers cette électrode et de même pour les cellules chargées négativement avec l'électrode négative. Les cellules non chargées tombent à la verticale. C'est ainsi que ton tri cellulaire se fait.

Pour répondre ensuite à ta deuxième question, en fait j'ai déjà tout dit. Ton intensité de fluorescence est fonction de ta quantité d'ADN. Donc quand tu obtient ta courbe de la taille (par exemple si c'est ton critère de sélection) en fonction de ton intensité de fluorescence, les cellules peu fluorescentes sont les cellules avec peu d'ADN et donc en phase G0 ou G1, les cellules avec une fluorescence intermédiaire sont celles qui sont en train de répliquer leur ADN et donc en phase S et les petites dernières les cellules en phase G2 ou M.

Enfin pour répondre à ta dernière question, il y a une grande hétérogénéité de répartition entre les cellules car comme les hommes, chacune réagit différement aux contraintes de son environnement. En fait, les cellules n'ayant pas entamé leur cycle cellulaire toutes en même temps, une analyse en cytométrie de flux sur des cellules non traitées te montrera que les cellules, à peu de choses près se répartissent dans les 3 catégories citées ci-avant. Notons que même lorsque tu traites tes cellules avec un inhibiteur du cycle cellulaire par exemple de la transition G1 - S, tu observeras quand même des cellules en phase S et d'autres en phase G2 - M.

Voilà pour ces quelques petites explications.

Si tu as besoin d'autres précisions je reste à ta disposition.

[inviteca614eab]

Salut

Pseudomonas a déjà tout dit. Je te joins une publi ou tu peux voir une figure correspondant à l'analyse par FACS du cycle cellulaire. Pour le nombre de cellules, le FACS est programmé pour en prélever un nombre prédéfini (en général 10 ou 20000). Il te donne ensuite une figure (Figure 2C) correspondant à ce qu'il y a dans la publi (après quelques petits réglages). i tu veux des détails sur le mode op de préparation des cellules avant analyse, n'hésites pas.

[invitee93ed335]

salut tous le monde et merci pour tous ces enrichissements .
une question qui m'echappe : comment peut-on distinquer entre les phases G0 et G1 d'une part et entre G2 et M d'autre part ?
si ce ci est impossible par la facs , y a t il d'autre methodes qui peuvent nous aider?
merci

[invitea7917db3]

Bonjour à tous!!

Je pense etre au bon endroit pour obtenir quelques renseignements..., je dois faire une presentation (ppt) de 20 min sur "3 nouvelles techniques d'etude du cycle celluaire n'utilisant plus d'isotopes radioactifs".
J'ai pensé à la cytométrie de flux, l'inactivation de gènes codant des proteines impliquer dans le cycle (ex : cdc cdk...) et l'immunofluorescence.
Le problème est que ces 3 techniques ne me semblent pas très "nouvelles!!" et elles se recoupent plus ou moins, elles ne sont pas clairement différentes (surtout la cytométrie et l'immunofluo)...
Pouvez vous me dire ce que vous en pensez, si vous connaisez d'autres techniques, et surtout si vous connaissez des liens des revues, des publications, des études générales sur ce sujet.

grand merci!!

[invitec25c96a0]

Bonjour,

Tu peux separer G1/GO en utilisant de l`acridine orange ou en faisant un double marquage Hoechst-pyronine ou en faisant un double marquage IP et un anti Ki67 (les cellules Ki67 neg sont considerees comme etant en G0).
Pour la phase G2/M tu peux faire un double marquage IP et un anti histone H3 phosphorylee.

Sinon, pour etudier le cycle tu peux faire du confocal avec des marquages contre differentes proteines ou structures.


cordialement

[invitee93ed335]

Bonjour,

Tu peux separer G1/GO en utilisant de l`acridine orange ou en faisant un double marquage Hoechst-pyronine ou en faisant un double marquage IP et un anti Ki67 (les cellules Ki67 neg sont considerees comme etant en G0).
Pour la phase G2/M tu peux faire un double marquage IP et un anti histone H3 phosphorylee.

Sinon, pour etudier le cycle tu peux faire du confocal avec des marquages contre differentes proteines ou structures.


cordialement

merci sansplom
si j'ai bien compris au debut on utilise un double marquage cad lors de la preparation de la susponsion cellulaire
ce double marquage va etre detecté par l'ordinateur qui va donner un histogramme . quelle est l'allure de cet histogramme et comment ce fait le tri dans ce cas est ce que en fonction des phases cad on obtient des cellules separées en fonction des phases du cycle ?
merci

[invitec25c96a0]

Bonjour,

c`est cela, tu ajoutes les colorants ou anticorps selon ton marquage, tu incubes et tu passes sur le cytometre.
En fait l`ordinateur te permet de visualiser les resultats sous forme dun histogramme ou d`un histogramme biparametrique.
J`ai mis quelques images avec differents marquages.
Pour isoler des sous populations on utilise un cytometre trieur (un FACS). On entoure les populations avec de regions que l`on dessine directement sur les histogrammes. sur les trieurs actuels tu peux isoler 4 populations en meme temps. Tu peux purifier par exemple les cellules en phase G0, G1, S et G2M en meme temps. Sur une machine bien reglee tu peux obtenir des puretes supereiures a 99%.

Cordialement

[invitec25c96a0]

re,

avec les images

[invitecf03b3a0]

Bonjour,

Je suis à la recherche de drogues bloquant les cellules dans certains phases du cycle cellulaire. Pourrait tu me les citer, s'il te plait?
Merci

TheStreet

[invitea0443c8c]

Bonjour.
Quelques détails dans cette discussions:

http://forums.futura-sciences.com/sh...125&highlight=

V.

[invitecf03b3a0]

salut,

Je suis pas certaines de comprendre ta question. Est-ce que tu veux savoir si le cycle cellulaire est modifié/altéré ? tu veux savoir comment on peut apprendre ça et avec quelle techniques ?
Si c'est ça, alors il existe plusieurs façon d'avoir accés au cycle cellulaire et àa son activité dans une cellule. Tu peux analyser l'expression de certaines cyclines et des cdk, en faisant un Q-PCR par exemple. Tu pourrais analyser l'expression de certaines protéines connues pour leur implication à différentes étape du cycle (lors de la réparation par exemple): ATM, ATR, Rad51...
Tu pourrais aussi utiliser des drogues pour réprimer ou favoriser l'entrée en cycle des cellules, en fait tout dépend de ce que tu veux voir. Si ça ne répond pas vraiment à ta question, tu peux préciser plus avant.

Voilà,
belouga7

Bonjour,

J'aimerai en savoir un peu plus sur ces drogues bloquant le cycle cellulaire dans certaines phases.
Merci

[invitea0443c8c]

Que voulez vous savoir exactement?

Plusieurs molécules permettent l'arrêt du cycle, et sont citées dans la précédente discussion.
- nocodazole ou colchicine en mitose
- thymidine en excès, hydroxy-urée, carence en sérum, pour la transition G1/S
- ....

V.

[invitecf03b3a0]

Bonjour.
Quelques détails dans cette discussions:

http://forums.futura-sciences.com/sh...125&highlight=

V.

Merci. D'après mes recherches, j'ai trouvé d'autres molécules bloquant le cycle comme l'aphidicolin,l'etoposide, ou bien le 5-Fu... En connaissez vous d'autres et savez vous quelles sont les drogues les plus utilisées en laboratoire?

Merci

[invite7eb2285b]

Bonjour The Street,

Synchronisation en G0:

Carence ou privation en facteurs de croissance par exemple par sevrage en sérum. Juste un peu de hors sujet par rapport à la question mais tant pis la science est notre guide: certaines cellules possèdent une inhibition de contact et entrent en G0 lorsqu'elles ont formé une couche cellulaire confluente.

Arrêt à la transition G1/S et en S:

Excès de thymidine (-> rétroinhibition de la ribonucléotide réductase), traitement à la mimosine (-> altération du métabolisme des désoxyribonucléotides), traitement à l'hydroxyurée (-> inhibition de la ribonucléotide réductase), traitement à l'aphidicoline (-> inhibition l'ADN polymérase alpha).

Arrêt en phase G2:

Ajout de molécules inhibitrices des topoisomérases exemple la génistéine (-> inhibition de la topoisomérase II), la camptothécine (-> inhibition de la topoisomérase I).

Arrêt en cours de mitose:

Drogues inhibant la polymérisation des microtubules comme: nocodazole, vinblastine, vincristine, colchicine, colcemide.
L'utilisation du taxol.
Méthode physique: "mitotic shake-off".

Je pense que ça devrait être suffisant en plus de celles que tu as déjà trouvées. Maintenant libre à toi de découvrir l"effet de chacune .

Cordialement.

[invitecf03b3a0]

Bonjour The Street,

Synchronisation en G0:

Carence ou privation en facteurs de croissance par exemple par sevrage en sérum. Juste un peu de hors sujet par rapport à la question mais tant pis la science est notre guide: certaines cellules possèdent une inhibition de contact et entrent en G0 lorsqu'elles ont formé une couche cellulaire confluente.

Arrêt à la transition G1/S et en S:

Excès de thymidine (-> rétroinhibition de la ribonucléotide réductase), traitement à la mimosine (-> altération du métabolisme des désoxyribonucléotides), traitement à l'hydroxyurée (-> inhibition de la ribonucléotide réductase), traitement à l'aphidicoline (-> inhibition l'ADN polymérase alpha).

Arrêt en phase G2:

Ajout de molécules inhibitrices des topoisomérases exemple la génistéine (-> inhibition de la topoisomérase II), la camptothécine (-> inhibition de la topoisomérase I).

Arrêt en cours de mitose:

Drogues inhibant la polymérisation des microtubules comme: nocodazole, vinblastine, vincristine, colchicine, colcemide.
L'utilisation du taxol.
Méthode physique: "mitotic shake-off".

Je pense que ça devrait être suffisant en plus de celles que tu as déjà trouvées. Maintenant libre à toi de découvrir l"effet de chacune .

Cordialement.

Merci beaucoup

The Street

[invite3450ade9]

Bonjour, juste un point de détail..
Il y'a une chose que je ne comprends pas.. l'iodure de propidium je crois ne passe pas la membrane plasmique..c'est pourquoi on utilise le double marquage iodure de propidium + annexine V-flurochrome pour détecter l'apoptose en cytométrie de flux. LEs cellules iodure de propidium négative et annexine V positive sont en apoptose , celle en nécrose sont iodure de propidium + et annexine V -, la membrane plasmique étant lésée l'iodure pénetre dans la cellules et intercale l'adn.
Donc ma question est comment on peut intercaler de l'adn avec de liodure de propidium dans des cellules vivantes ? qui ont une membrane plasmique intact, pour étudier le cycle cellulaire notamment..On lyse la membrane avant et on analyse la fluoresecence de l'ADN c'est ca? sinon je ne vois pas comment vu qu'il ne traverse pas la membrane plasmique...
Merci pour la réponse!

[invite71f23525]

Oui par contre un bémol sur le nocodazole qui ne fait pas que bloquer les cellules en mitose en empêchant la polymérisation des microtubules, mais qui induit aussi des dommages chromosomiques spectaculaires. On ne sait pas encore pourquoi ni comment mais le fait est qu'il y a le marqueur des cassures double brin (H2AX) qui est phosphorylée et certains noyaux en DAPI sont explosés, donc l'effet est bien là. Le résultat est plus propre avec un traitement au paclitaxel (nom commercial taxol).

Pour le marquage à l'iodure de propidium, dans le cas d'une étude du cycle cellulaire, on fait une fixation dans l'éthanol à 70% ce qui fait office de perméabilisation pour la pénétration de l'iodure de propidium dans la cellule. Dans le cas d'une étude de l'apoptose avec co-marquage à l'annexin V, on ne fai pas cette fixation à l'éthanol, on met directement les cellules en présence d'iodure de propidium, de RNase A (pour augmenter la proportion d'iodure de propidium se fixant à l'ADN) et l'Annexin V. Dans ce dernier cas comme tu l'as précisé, la membrane plasmique est imperméable et nécessite d'être lysée pour que l'iodure de propidium rentre dans la cellule, donc nécrose.

Greg

[invitebe208abd]

Salut!

Greg quand tu dis que l'IP rentre dans les cellules nécrotiques car la membrane est permeable car lésée, l'IP peut donc servir à caractériser l'apoptose à un stade avancé, par rapport à un début d'apoptose?
L'annexine peut etre utilisée pour repérer les cellules en début d'apoptose seulement puisque non permeables à l'IP?

Cordialement

[invite0cd70211]

Bonjour chers amis du forum,

Je tiens tout d'abord à vous remercier pour vos différents éclaircissements sur le sujet (cycle cellulaire). J'ai une question consernant la synchronisation des cellules à une phase donnée ( J'ai bien compris vos différentes explications), mais mon réel souci est de savoir si après avoir synchronisées les cellules en G0 ou G1 par exemple, les cellules peuvent encore se diviser (redémarrer) si je les traite avec un agent mitogène ou le serum.
Ma deuxième question porte sur le double marquage PI et Ki67 ou PCNA. L'aviez vous déjà fait ? si oui, faut il forcément faire une perméabilisation au Paraformaldéhyde sachant que mes cellules vont être ou ont été fixées à l'alcool ? Si vous avez des conseils pratiques, je suis bien disposé à les recevoir.
Merci de me repondre et surtout merci de votre attention.
Leonard DV.