Construire un vecteur de transgenèse dérivé des transposons

[invite174905fb]

Bonjour à tous !

Comme l'indique mon titre, nous étudions en ce moment en cours dans le cadre d'un tp de génétique, la transgenèse.

J'aimerai avoir quelques explications sur le transposon. Où est ce qu'on le trouve à l'origine? Est ce qu'il reconnait toujours la même séquence nucléotidique? Quels sont les mécanismes qui lui permettent de faire passer un gène d'intérêt dans un vecteur (plasmide). Et est ce que tout ça a lieu dans la cellule cible, ou est ce que ce sont des étape de la transgenèse qui se font avant de toucher à la cellule cible?

J'espère ne pas avoir été trop brouillon lol

J'vous remercie d'avance pour vos réponses.
-----

[invitebe38ce14]

Tout d'abord, les transposons sont des séquences nucléotidiques naturellement présentes dans les génomes. Ces élément sont mobiles, ils portent un gène codant pour une Transposase, celle-ci synthétisée, le transposon va etre exisé du génome et il va s'inserer ailleur sur le meme mécanisme d'exision-ligation...
D'après ce que je sais, les transposons reconnaissent différentes sequences selon leurs familles d'appartenance, cad, certains sont spécifiques de 4-6 nucléotides et d'autres s'inserent dans des 'hot-spot', séquences bcp moins homologues... Quois qu'il en soit, le transposon possède de très nombreux sites potentiel d'insertion dans un génome complet, c'est pourquois il est utilisé pour réaliser dans campagne de mutagénèse aléatoire.
Les gènes d'interets du transposon seront les gènes que tu cloneras à l'interieur de celui-ci : gène de résistance pour la plus part des cas. Le clonage réalisé, le transposon sera cloné dans un vecteur non réplicatif pour forcer son insertion chromosomique.
Après la transfomation de la cellule cible, une séléction ou un screen seront réalisés afin d'isoler le gène cible inactivé.
La principale utilité des transposons est de réaliser des K-O aléatoires (inactivation de gène), je ne pense pas que ton utilisation du transposon soit de faire une insertion chromosomique monocopie...

(P.S: excusez moi pour les fautes d'orthographes...)

[MaliciaR]

Salut,

Quels sont les mécanismes qui lui permettent de faire passer un gène d'intérêt dans un vecteur (plasmide).

Je ne comprends pas du tout cette phrase : de quel transposon parle-t-on? Est-ce que tu t'intéresses à une disruption de gène par insertion du Tn10 (le chéri de tout le monde) ou à une mutagenèse insertionnelle aléatoire par Mu...?
Parce que ce que tu as l'air de vouloir décrire comme transgenèse a une tête assez classique, mais cette histoire de transposon me perturbe...
Peux-tu préciser ton niveau d'études, stp, afin que les réponses qu'on te donne soient adaptées

Les gènes d'interets du transposon seront les gènes que tu cloneras à l'interieur de celui-ci : gène de résistance pour la plus part des cas. Le clonage réalisé, le transposon sera cloné dans un vecteur non réplicatif pour forcer son insertion chromosomique.
Après la transfomation de la cellule cible, une séléction ou un screen seront réalisés afin d'isoler le gène cible inactivé.
La principale utilité des transposons est de réaliser des K-O aléatoires (inactivation de gène), je ne pense pas que ton utilisation du transposon soit de faire une insertion chromosomique monocopie...

Est-ce qu'on est obligé d'introduire un gène de résistance? J'avais lu un papier où les gars faisaient leur mutagenèse avec le transposon (en l'occurrence, Mu) et puis une PCR linéaire avec primers dégénérés + séquençage pour avoir la séquence au sein de laquelle il s'est inséré.

Cordialement,

[invite02cefc91]

AH non non tu n'es pas obligé de mettre une gène de resistance, comme tu le dis on peux s'en servir comme agent mutagène

[A voir en vidéo sur Futura]

[MaliciaR]

Merci, Malesore
Mais ceci dit, je ne comprends toujours pas pourquoi utiliser un transposon pour introduire un gène d'intérêt dans un plasmide... Si je veux l'introduire in fine dans le chromosome bactérien, je peux très bien faire une cassette avec des extrémités précises où une recombinaison homologue pourra se faire...
Et puis, je me demande quel est ce TP où on fait des manips si complexes (ou qui en ont l'air, en tout cas)...? Je veux dire, même nous en M1 on nous a bassinés avec une transfo à la con et un clonage digne de la halte-garderie

Cordialement,

[invitebe38ce14]

Salut,

Est-ce qu'on est obligé d'introduire un gène de résistance? J'avais lu un papier où les gars faisaient leur mutagenèse avec le transposon (en l'occurrence, Mu) et puis une PCR linéaire avec primers dégénérés + séquençage pour avoir la séquence au sein de laquelle il s'est inséré.

Cordialement,

Rien à voir avec la question initiale, mais comment tu gardes ta souche mutée de facon stable?
Le transposon a tout ce qui faut pour repartir et lors de repiquages sans pression de séléction tu privilègieras les revertants (toujours mieux adapté vu qu'ils sont wt)...
Ou alors la transposase est apportée en trans?
Parce que je suis le roi des revertants!

[MaliciaR]

Rien à voir avec la question initiale, mais comment tu gardes ta souche mutée de facon stable?
Le transposon a tout ce qui faut pour repartir et lors de repiquages sans pression de séléction tu privilègieras les revertants (toujours mieux adapté vu qu'ils sont wt)...
Ou alors la transposase est apportée en trans?
Parce que je suis le roi des revertants!

Je ne connais pas bien la mutagenèse par transposons, tu veux bien approfondir?
Ceci dit, je peux toujours introduire un gène de résistance en plus, question justement d'entretenir la souche mutante...
Ou alors, oui, tu fais un plasmide supplémentaire portant le gène de la transposase mais sans les séquences répétées inversées.

Cordialement,

[inviteea49608c]

les transposons sont des sequences nucleotidiques presentes naturellement dans le genomes representes environ 50% de l'ADN total sont des elements mobiles

[invite174905fb]

Merci à vous de vous intéresser à mon sujet pour essayer de répondre à mes qustions!

Désolé de ne répondre que maintenant, mais j'ai du mal à avoir accès à internet en ce moment.

Je suis actuellement en L2 bio option BTA (BioTechnologie Animale). Dans cette otpion nous étudions la transgènese. Pour le moment nous n'avons pas encore réalisé quoi que ce soit, nous n'avons fait que de la théorie, mais nous commençons la pratique la semaine prochaine. Bien évidement nous (étudiants) n'allons pas réaliser toutes les manipulation de la transgènese, par manque de temps (4h30 de tp par semaine pour cette option) et certainement aussi par manque de connaissances, mais nous devons être capable de comprendre le fonctionnement (et puis en plus ça m'interesse de savoir comment tout ça fonctionne). C'est justement ce manque de temps qui fait que le prof n'a pas été très clair dans ces explications.

J'vais essayer de vous expliquer le but de ce tp (en espérant ne pas racontrer trop de "conneries"):

-Pénétration du transgène dans une cellule cible via un vecteur(plasmide) par transformation ou transfection

-Intégration du trangène dans le génome via un transposon (mais je ne sais pas lequel).

Pour ce faire nous allons devoir utiliser 3 vecteurs, ce qui ne facilite pas les choses lol. pBCKS+, pGEMT et PBR322:

-pBCKS+ parce qu'il a un gène codant pour la chloramphenicol, marqueur qui va nous permettre de reconnaitre les bactéries avec les bons plasmides.

-pGEMT: j'ai pas très bien compris le pourquoi du comment.

-pBR322 parce que c'est lui qui a le gène de la Tétracycline: Tet (le gène qu'on cherche à introduire).

1-Là ce qu'on veut c'est repérer Tet dans pBR322. Isoler tout ce gène sans son promoteur pour le cloner dans pBCKS+.
Pour ce faire nous allons réaliser une PCR du gène Tet avec deux amorces contenant des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction XbaI et HindIII. Visiblement les amplicons obtenus possèdent à chaques extrémités le site de reconnaissance pour ces enzymes de restrictions et une Adénosine (d'ailleurs là j'ai pas compris d'où elle vient).

2-Ensuite on veut insérer cet amplicon dans pGEMT, ce qui est apparement possible grace aux Thymines qu'il y a dans le gène LacZ de pGEMT (là encore j'ai pas tout bien saisi).

3-On introduit les enzymes de restrictions XbaI et HindIII. on va avoir le fragment Tet qu'on va ensuite insérer dans pBCKs+.

Voilà ce qui nous a été expliqué en cours. Les infos fusées dans tous les sens alors j'espère ne pas avoir été trop à côté de la plaque en essayant de remettre les choses dans l'ordre. J'pense vous avoir donné un max d'info sur mon sujet.

Je remercie d'avance ceux qui prendront le temps de tout lire (j'suis désolé c'est long) et de m'aider.

[MaliciaR]

Bonjour,

pas mal ton sujet! Mais je trouve franchement dommage que vous n'ayez que 4h30 pour voir tout ça en pratique.

Pour ce faire nous allons devoir utiliser 3 vecteurs, ce qui ne facilite pas les choses lol. pBCKS+, pGEMT et PBR322:

-pBCKS+ parce qu'il a un gène codant pour la chloramphenicol, marqueur qui va nous permettre de reconnaitre les bactéries avec les bons plasmides.

Il n'y a pas de "bons" plasmides Le marqueur te permettra de reconnaître et sélectionner les cellules ayant reçu le plasmide pBCKS.

-pGEMT: j'ai pas très bien compris le pourquoi du comment.

Si je ne m'abuse, pGEMT est un vecteur qui permet le clonage direct de produits de PCR (de chez Promega, si je n'abuse toujours pas ).

Cela s'explique plus bas , dans le point 2 que tu as énoncé.
Ce qui s'explique également dans ce même point est cette histoire de A et T. En fait, pGEMT a été linéarisé et on a ajouté une T en 3'. C'est pourquoi, tu as besoin de rajouter une A au niveau de tes amplicons, sinon la ligation ne risque pas de marcher.
D'où vient l'A? Tout simplement, on l'a rajouté au niveau des oligos Tu peux carrément pousser plus loin si tu as besoin, en ajoutant des sites de restriction par le biais des oligos. Ca s'appelle PCR d'assemblage.

-pBR322 parce que c'est lui qui a le gène de la Tétracycline: Tet (le gène qu'on cherche à introduire).

1-Là ce qu'on veut c'est repérer Tet dans pBR322. Isoler tout ce gène sans son promoteur pour le cloner dans pBCKS+.
Pour ce faire nous allons réaliser une PCR du gène Tet avec deux amorces contenant des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction XbaI et HindIII. Visiblement les amplicons obtenus possèdent à chaques extrémités le site de reconnaissance pour ces enzymes de restrictions et une Adénosine (d'ailleurs là j'ai pas compris d'où elle vient).

2-Ensuite on veut insérer cet amplicon dans pGEMT, ce qui est apparement possible grace aux Thymines qu'il y a dans le gène LacZ de pGEMT (là encore j'ai pas tout bien saisi).

3-On introduit les enzymes de restrictions XbaI et HindIII. on va avoir le fragment Tet qu'on va ensuite insérer dans pBCKs+.

Donc, pour résumer :
* tu as pBCKS portant le gène de résistance à la chloramphénicole;
* tu as pGEMT qui recevra un amplicon;
* tu as pBR322 qui porte le gène de résistance à la Tet.
Tu fais une PCR afin d'obtenir le gène de résistance à la Tet ("promotorless"); les amplicons seront clonés dans pGEMT, tu fais tes cribles, enfin tu clones ce gène dans pBCKS et tu sélectionnes sur Chloramphénicol et Tét.

Est-ce cela?

Par ailleurs, je n'ai toujours pas vu une trace de transposon dans cette histoire
Je te conseille vivement de faire des schémas lorsque tu as affaire à des histoires d'amour pareilles.

Cordialement,

[doubleD]

salut
pour le A, la plupart des Taq polymérases le rajoutent automatiquement lors de la pCR, pas besoin d'y penser dans le design de l'amorce. C'est pour ça que le pGEM-T ou pGEMT-easy sont pratiques: on fait une PCR, oin purifie la PCR (ça marche sans des fois d'ailleurs) et on ligue directement dans le vecteur. C'est donc simple et rapide

[invite174905fb]

Oui MaliciaR c'est bien cela, et pour être franc je ne sais pas à quel moment est-ce qu'on se serre des ces transposons, mais étant donné que le prof nous en a parlé en cours, je suppose que ça a son importance dans la manipulation, mais quand, telle est la question?
Par contre es tu sûr que T a été rajouté? J'avais cru comprendre qu'il existait déjà dans le plasmide, mais ce que je ne comprenait pas c'est comment ce "T" plus qu'un autre était reconnu par le A (parce qu'apparement l'amplicon se fixe à un endroit précis sur pGEMT)?

Maintenant que tu me dis ça doubleD, au sujet du A rajouté par la Taq polymérase, ça me dis quelque chose, j'ai déjà dû le lire quelque part. Parce qu'en fait pour tout vous dire, nous n'avons pas encore étudier la PCR en cours, et j'espère que nous allons le faire pour que ce soit plus clair, on nous a dit que ça intervenait dans cette manipulation, mais c'est à nous de nous documenter sur le fonctionnement, et il me semble donc avoir lu ça quelque part.

Merci à vous deux.

[MaliciaR]

salut
pour le A, la plupart des Taq polymérases le rajoutent automatiquement lors de la pCR, pas besoin d'y penser dans le design de l'amorce.

Tu es sûr de ton coup là? Ca me laisse perplexe : je sais que la Taq a un taux d'erreur assez important (par rapport à Pfu, par exemple ), mais de là à dire que la Taq rajoute toute seule un nucléotide précis à l'extrémité d'un oligo pour que ce nucléotide assure le bout cohésif qu'il faut pour le plasmide... je t'avoue ne pas être sûre de ce truc.
Tu peux expliciter, stp?

Oui MaliciaR c'est bien cela, et pour être franc je ne sais pas à quel moment est-ce qu'on se serre des ces transposons, mais étant donné que le prof nous en a parlé en cours, je suppose que ça a son importance dans la manipulation, mais quand, telle est la question?

Il faut voir si tout ce que vous faites en cours est destiné à servir à ce TP précisément

Par contre es tu sûr que T a été rajouté? J'avais cru comprendre qu'il existait déjà dans le plasmide, mais ce que je ne comprenait pas c'est comment ce "T" plus qu'un autre était reconnu par le A (parce qu'apparement l'amplicon se fixe à un endroit précis sur pGEMT)?

C'est un truc précis du pGEMT :
These vectors have been linearized and have had 3′-terminal thymidine nucleotides added. (c'est ce qui est dit sur le site de Promega).
Je ne suis pas sûre que tu aies compris le principe du clonage en fait, vu ta question sur la reconnaissance entre T et A...
Dis, pourquoi on coupe avec ces enzymes de restriction précisément? est-ce que tu as sous les yeux la carte génétique du plasmide avec son MCS?

Par ailleurs, je te conseille de te documenter au sujet de la PCR assez rapidement. Tu y verras plus clair ensuite

Cordialement,

[MaliciaR]

DoubleD, considère que je n'ai rien dit!
Effectivement, je viens de revoir de vieux cours sur la PCR et me souvenir que la Taq le fait car elle n'a pas d'activité 3'-5' exonucléase

Cordialement,

[jmbowie]

DoubleD, considère que je n'ai rien dit!
Effectivement, je viens de revoir de vieux cours sur la PCR et me souvenir que la Taq le fait car elle n'a pas d'activité 3'-5' exonucléase

Cordialement,

Et je confirme qu'elle rajoute des A protubérants. Il y a d'autres plasmides de la sorte (comme pCR 2.1 des kits Topo d'Invitrogen). Le "souci" (cela dépend des besoins) c'est que l'on ne contrôle pas l'orientation de l'insert.

[MaliciaR]

Et je confirme qu'elle rajoute des A protubérants. Il y a d'autres plasmides de la sorte (comme pCR 2.1 des kits Topo d'Invitrogen). Le "souci" (cela dépend des besoins) c'est que l'on ne contrôle pas l'orientation de l'insert.

Il est trèèès bien le pTOPO
Sinon, si tu veux orienter l'insert, tu coupes par deux enzymes de restriction. En tout cas, c'est ce qu'on nous a appris à l'école

Cordialement,

[invite174905fb]

Salut à vous tous!!!

Ca y est j'ai fait un des tp et j'en ai donc profité pour demander à quel moment on allait utiliser ces fameux transposons. Visiblement nous n'allons pas les utiliser En fait elle nous en a parlait parce que c'est une étape qui se fait après avoir fait tout ce que j'vous ai décrit précédemment, c'était histoire de nous expliquer comment la manipulation complète se dérouler, mais nous, nous nous arrêtons à l'insertion de Tet dans pBR322.

Voilà, en tout cas merci à tous pour vos réponses et d'avoir pris le temps de réfléchir à mon sujet.