Dosage Acide Aminé

[invitead282ff2]

Bonjour,

je ne savais trop comment intituler mon post, mais, voici mon soucis.
Je cherche à reconstituer un complexe et à en déterminer la stoechiométrie, à savoir, déterminer combien de protéines A interagissent avec combien de protéines B.

Sachant que ma protéine A possède 64 Leu+Ile pour une taille de 448 acides aminés.
J'ai donc un %(I+L) = (64/448), soit 14,28%

Ma protéine B possède 32 I+L pour une taille de 343 acides aminés.
Donc, %(I+L) = 9,33%.

On a déterminé par hydrolyse acide la composition en acides aminés de notre complexe A-B.
On obtient un pourcentage de I+L = 13,9%.

Pour déterminer la stoechiométrie, j'ai donc fait le calcul suivant :

%(I+L) du complexe A-B = x (%(I+L)A) + y (%(I+L)B)
x + y = 1

Soit,
13,9 = 14,28x + 9,37y

J'obtient alors un y = (14,28-13,9)/(14,28-9,33) = 0,07676, soit un rapport 1 pour 13.

J'aurais donc un ratio 12 A pour une B.

La personne ayant conduite ses manip' a quitté le labo il y a des années et, à partir de mêmes données, a déterminé une stoechiométrie 6A pour 1B.

Je n'arrive pas à comprendre en quoi ma façon de calculer est fausse...
Peut être que le fait de raisonner en pourcentage implique telle un biais que je ne saisis pas?


Nous allons de toute façon procéder à d'autres analyses pour déterminer la stoechiométrie. Néanmoins, j'aimerais comprendre les résultats de cette précédente expérience et surtout son interprétation.

Si quelqu'un peut me corriger, j'en serais très heureux.

Merci,

Morphine
-----

[invite8c0cc995]

Je ne suis pas un spécialiste de cette technique, mais votre raisonnement semble correcte.
Néanmoins, avez vous purifié votre complexe par chromato, le complexe A-B est il pur, est il possible qu'il y ait du B seul, ou du B complexé à un nombre variable de A qui puisse fausser les résultats ?
En outre, quelle est la précision de la détermination par hydrolyse, car pour un ratio 1:6, cela signifie que vous auriez du avoir x=85% et y=15% (85/15~6), en faisant le calcul à l'envers, cela vous donne un resultat d'hydrolyse de 13,54 ! Donc je ne sais pas d'après votre technique si une variation de 2.5% est significative.

Cordialement,

[invitead282ff2]

Bonjour,
tout d'abord, merci d'avoir pris le temps de répondre.
Les deux protéines ont été purifié purifuées indépendamment et le complexe a été reconstitué in vitro, puis, lui même "purifié" par gel filtration S200.
Cependant, la taille des complexes formés est telle que la résolution sur gel filtration est limite. On ne peux donc pas exclure l'une ou l'autre des rapport 1/6 ou 1/12 par simple gel filtration (voire un mélange...), d'autant plus qu'une des deux protéines est partiellement dépliée et donc augmente le volume hydrodynamique du complexe.

Je vais mener une expérience de MALS afin de déterminer les masses moléculaires exactes. Même si je me dis que la spectro de masse pourrait peut être répondre à cette question elle aussi.

Concernant cette expérience, j'essaye actuellement de rentrer en contact avec le chimiste l'ayant réalisé afin qu'il puisse lui même me donner le dégré de précision.
C'est vrai qu'une variation de 2,5% me semble difficilement permettre de répondre à ma question.

Merci pour votre réponse et votre attention.

Cordialement,
Morphine