Deux bandes en PCR

[invitef69f87d5]

Bonjour tout le monde
Je reviens de TP où on a eu des résultats bizare. On a réalisé une PCR classique sur un fragment d'ADN, et lorsque l'on a migré les produits il y avait deux bandes l'une à la taille attendu (500Pb) l'autre presque deux fois plus petite (300Pb).
On a du mal a expliquer ces résultats. Notre théorie c'est que les amorces étaient contaminées avec d'autres amorces. Il peut aussi y avoir un problème dans les dillutions des Amorces. Est- ce qu'un problème de dillution peut expliquer ce résultats.
Avez vous déja rencontré ce résultats??
Merci d'avance pour vos réponses.
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[MaliciaR]

Bonjour,

Notre théorie c'est que les amorces étaient contaminées avec d'autres amorces.

Ah oui? Tu peux exiger de te faire rembourser par ton fournisseur alors
Comment ça, une contamination? Par des amorces qui en plus produisent des amplicons sur ta séquence d'intérêt...? Pas mal, ça
Tu crois que c'est une bonne piste...?

Il peut aussi y avoir un problème dans les dillutions des Amorces. Est- ce qu'un problème de dillution peut expliquer ce résultats.

Tu veux bien détailler un peu plus cette idée?
Sinon, oui, il m'est arrivé la même chose aujourd'hui Avec le gène humain, bien sûr, les gènes de procaryotes ne sont pas aussi nuls


Cordialement,

[Yoyo]

salut

Il est plus probable que ton probleme provienne d'hybridation aspecifique de tes amorces sur le genome. En augmentant la temperature d'hybridation tu devrais résoudre le probleme. Autre possibilité, Il y a d'autres sites de fixation de tes amorces dans le génome.

YOyo

[invitef69f87d5]

Tout d'abord merci pour vos réponses..
Alors pour la théorie de la contamination ce sont des amorces utiliséees pour essentiellement faire des TP avec des étudiants donc une contaminations par d'autres amorces peut ètre possible.
Sinon pour l'hybridation aspécifique, l'autre groupe (je rappelle que c'est dans le cadre d'un TP) n'a pas eu ce soucis, donc cette théorie ne me parrait pas trés posible dans ce cas..Et on fait ça sur des plasmides alors la fixation sur un autre site reste limité je pense.
Sinon pour notre théorie de la dillution je ne suis pas sure que ça tienne la route, en gros s'il une des amorces est en trop faible quantité la PCR se fait que sur un des brins, et selon l'amorce la taille du fragment synthétisé n'est pas forcément la même ( a quelque pb prés, je crois que c'est juste ça..). Mais cette théorie n'est pas la mienne alors je ne suis pas sure de l'explication..
Si vous avez d'autres explication plus claire, je suis prenante..

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Des plasmides? C'est pour tester des clones avec un insert? Juste comme ça, le plasmide vide donne une bande? Normalement oui. A quelle taille?

[invitef69f87d5]

Alors on n'a pas testé le plasmide vide. On fait une PCR afin d'amplifier une séquence pour faire une sonde pour un southern blot.
Donc d'aprés toi si avec le plasmide vide il y a une bande qui correspond à la bande "inattendue" c'est que la pCR a amplifié une séquence sur le plasmide...
Mais comment tu explique que l'un des grouoes n'a pas cette bande??

[piwi]

Tous les groupes ont les deux bandes sauf un? Vous travaillez tous avec le même plasmide ou vous avez fait chacun une prep à partir d'une colonie bactérienne?

[invitef69f87d5]

On est que deux groupes, l'autre goupe a fait la PCR la semaine dernière. On travaille sur les mêmes plasmides, c'est le prof qui nous la fourni, on n'a pas fait chacun notre prep..
J'avoue que ça m'intrigue car même le prof ne trouve pas d'explication...
On coince sur ce point et j'aimerais comprendre..Mais je ne sais pas si je maitrise la théorie de la PCR assez pour en comprendre toutes les subtilités..C'est avec ce genre de problèmes qu'on peut se poser des questions aux quelles on n'aurait pas penser sans ça..

[Yoyo]

salut

tu n'aurais pas une photo qu'on voi ce que ca donne. A mon avis c'est de l'aspecifique a 99%.

YOyo

[piwi]

Moi aussi je voudrais bien voir les bandes. Vu ce que l'on déjà discuté, j'en viens aussi à suspecter une amplification aspécifique.

[invitef69f87d5]

j'essaye de mettre une photo

[invitef69f87d5]

je sais pas si ça a marché

[invitef69f87d5]

Le voulais juste dire les trois premier puits c'est le produit de PCR sur de l'ADN génomique, les suivants c'est sur de l'ADN du plasmide.

[invitef69f87d5]

Bon je rajoute encore autre chose, les bandes qui sont en haut au niveau ces PCR faits sur les plasmides on est sencé pouvoir l'expliquer (ça j'ai pas encore réfléchi dessus) Ce sont les deux bandes du bas qui me pose problème..

[Yoyo]

merci pour l'image.
Donc si je comprends bien ce sont les deux bandes du bas qui t'interesse. Tu pourrais nous donner les tailles du marqueur stp?
YOyo

EDIT: tu peux nous preciser le but de cette experience stp?

[invitef69f87d5]

Alors si je ne me trompe pas la dernière est a 250 pb et la deuxième à 500.Les autres je n'est pas retenu
Sinon le but de l'expérience est purement de l'apprentissege technique pour qu'on soit capable de faire un southern.. A partir d'un plasmide ou d'ADNgénomique on fabrique les sondes..(Dans le reste du TP on transfecte des cellules avec PPAR, RXR un plasmide raporteur qui contient les séquences de liaison au PPAR, ou avec une séquence que l'on veut tester quant à la fixation de PPAR....Mais le southern est juste la pour que l'on voit la technique...)

[piwi]

Il est où le contrôle eau? Parce que là comme ça on ne peut normalement rien dire! Vous pouvez aller tarter le prof.
Avec un contrôle eau on aurait tout de suite vu si une bande est due à une contamination ou pas.

Maintenant vous avez une énorme amplification (vous avez mis combien de plasmide? Remarquez, j'en ai une petite idée ) Dans ces cas là on parfois des dédoublements de bande ou l'impression que la bande est plus haute ou plus basse qu'attendu. A mon avis vous pouvez refaire votre PCR avec 10x moins de plasmides (parce que là vous en avez pas mal quand même) et vous n'aurez plus qu'une bande à la bonne taille. N'oubliez pas le contrôle eau la prochaine fois

[invitef69f87d5]

Tu entends quoi par controle eau???(En plus le prof nous soule parceque soitdisant les chercheurs ne font pas assez de controle....)
Mais on n'a pas fait de controle eau..Je pense qu'il ne s'attendait pas a ce que ça ne marche pas.......
Je n'ai pas la quantité de plasmide utilisé...(ya pas la concentration et pas pensé à demandé...)
En tout cas ton explication me "plait", ça expliquerait par exemple que les autres groupes n'aient pas ça...

[Yoyo]

c'est clair qu'il manque certains controles
Ceci dit la quantité de plasmide ne me semble pas etre la cause du soucis, vu que les trois premieres pistes ne contiennent que de l'ADNg si j'ai bien compris. Et la bande d'amplification est tres forte aussi.

Ce qui m'intrigue est que dans ton premier message tu parles d'une bande attendue a 500pb, ca signifierait que c'est la bande la plus faible qui est celle que vous attendez? tu peux confirmer stp?

Il n'est pas impossible qu'il y ait eut un probleme de migration car la bande tout en haut semble aussi se dedoubler.

Yoyo

[invitef69f87d5]

Alors en effet normalement notre bande est à 496pb, donc a priori ça serait la plus haute des deux...
En tout cas merci beaucoup pour votre aide...C'est génial
Bon moi je vous abandonne pour ce soir
Je vous donne des nouvelles demain..
Mais n'hésitez pas à continuer ce sera lu avec soin...

[piwi]

Effectivement j'ai négligé l'ADN génomique. Donc non c'est pas la quantité de plasmide. Cependant je maintiens que ça n'est pas deux bandes mais un dédoublement d'une seule bande du fait de la masse d'ADN que vous avez produit. Ca arrive, c'est rien.

[Yoyo]

Effectivement j'ai négligé l'ADN génomique. Donc non c'est pas la quantité de plasmide. Cependant je maintiens que ça n'est pas deux bandes mais un dédoublement d'une seule bande du fait de la masse d'ADN que vous avez produit. Ca arrive, c'est rien.

dans ce cas la tu ne crois pas que ca serait la bande attendue (la bande du dessus) qui devrait etre la plus intense? Sans compter que les deux bandes sont vraiment nettes et bien séparées.

YOyo

[piwi]

Bof... Avec les PCR j'ai à peu près tout vu. Moi ça ne m'étonne pas plus que ça

[Yoyo]

Bof... Avec les PCR j'ai à peu près tout vu. Moi ça ne m'étonne pas plus que ça

tu n'as pas tord mais je doute qu'on puisse mettre suffisament d'ADNg pour obtenir le meme genre de probleme... a moins qu'ils en ait reellement mis des tonnes

nanane21 vous avez mis plus d'ADN que l'autre groupe pour faire vos PCR?

Tu penses que c'est quoi la bande supérieure ? j'ai ma petite idée mais je suis curieux de voir ce que tu en penses

Yoyo

[piwi]

mais je doute qu'on puisse mettre suffisament d'ADNg pour obtenir le meme genre de probleme

Là dessus il y a effectivement une petite remarque à faire. On voit que l'on a la même intensité de bande pour l'ADN produit à partir de l'ADNg et du plasmide. On peut penser ( ) qu'il y a pas mal de plasmide comme matrice pour les PCR. Du coup c'est vrai que l'on a du mal à imaginer que l'on ait mis autant d'ADNg. Mon avis c'est que la PCR est saturée ici. On a produit le maximum que l'on pouvait.

Une petite question: combien de cycle pour la PCR?
Pour un plasmide je n'excède jamais 20 cycles.

Tant que l'on y ait, quelle était la durée de la phase d'élongation?

Cordialement,
piwi

[IngDr]

Le controle "eau", sans ADN aurait aussi permis de voir s'il ne s'agit pas d'un super dimer de primer (ce qui peut arriver si vous avez mis trop de primer ou s'ils ne sont pas bien dessinés, mais pour des clonages, on n'a pas toujours trop de choix...)

Sinon, le % du gel n'est pas ce qu'il y a de plus adapté pour une bande attendue à 300bp

[invitef69f87d5]

Coucou...
Alors On a mis les mêmes quantité dans les deux groupes (si les dosages sont bien réalisés...). Pour le nombre de cycles et les durées je ne les ais pas en tête et j'ai pas mon poly sous la main..
Sinon le prof n'est pas d'accord avec la théorie d'une migration foireuse...Mais comme je vous le dis moi je n'ai vraiment pas assez d'expérience pour en dire quoi que ce soit..
Sinon pour la bande supérieure je pensait que c'est le plasmide (donc non amplifié) mais je ne sais pas si c'est détectable sans amplification avec les quantités que l'on a utilisé.(pareil le manque d'expérience) sinon je n'ai pas d'autres idées..
Sinon pour les quantités mises comme je vous le disais je n'ai pas les quantités, mais puisqu'on fait une amplification afin de réaliser une sonde peut étre que l'on a bien chargé pour être sur d'en avoir assez...(On a tout migré sur le gel puis on la récupéré aprés migration pour synthétiser la sonde)

MERCI pour vos réponses

[invitef69f87d5]

J'ai une question..Vous savez pourquoi le fait de mettre trop de matériel peut provoquer un dédoublement des bandes??

[MaliciaR]

Salut,

Sinon pour la bande supérieure je pensait que c'est le plasmide (donc non amplifié) mais je ne sais pas si c'est détectable sans amplification avec les quantités que l'on a utilisé.(pareil le manque d'expérience) sinon je n'ai pas d'autres idées..

Un plasmide de 500 pb? Ou j'ai raté un épisode...

Cordialement,

[invitef69f87d5]

Non je parlais des bandes qui sont beaucoup plus faible, en gaut du gel..La bande à 500pb c'est le fragment d'ADN que l'on a amplifié par PCR..