PCR avec augmentation de la T°C d'hybridation?

[MaliciaR]

Bonjour,

J'aurai besoin d'un petit conseil J'ai un fragment à PCRiser, mais un souci (ça ne peut jamais aller, pff ).

Donc, l'un des primers a une Tm de 56°C, l'autre de 66°C; j'ai pris pour T°C d'hybridation 56°C et, ô surprise, j'avais un amplicon qui n'était pas celui que j'attendais... Il est de taille nettement inférieure et en grosse quantité.
J'ai fait une autre PCR avec une T°C d'hybridation de 60°C et j'ai eu une pauvre petite bande correspondant à ce que j'attendais et bien sûr, une grosse bande correspondant à l'amplicon non spécifique.

Ca me dit que je devrais envisager une PCR où la T°C d'hybridation change en devenant plus élevée, mais comment faire? Je compte partir de 60°C et arriver à ...? Comment faire pour savoir où m'arrêter?

Merci

Cordialement,
-----

[gorben]

Salut,

Donc, l'un des primers a une Tm de 56°C, l'autre de 66°C; j'ai pris pour T°C d'hybridation 56°C et, ô surprise, j'avais un amplicon qui n'était pas celui que j'attendais... Il est de taille nettement inférieure et en grosse quantité.

Et tu n'a pas obtenu ton amplicon specifique??

J'ai fait une autre PCR avec une T°C d'hybridation de 60°C et j'ai eu une pauvre petite bande correspondant à ce que j'attendais et bien sûr, une grosse bande correspondant à l'amplicon non spécifique.

ca c'est pas bon, ca veux dire que ton amorce a 56 ne s'hybride pas suffisement sur ton site specifique pour avoir un rendement convenable, et que ton site non spe lui est tres tres bon

Ca me dit que je devrais envisager une PCR où la T°C d'hybridation change en devenant plus élevée, mais comment faire? Je compte partir de 60°C et arriver à ...? Comment faire pour savoir où m'arrêter?

Honnetement, tu peux tenter 65 deg mais j'y crois pas trop.
Soit tu commande un oligo qui soit specifique de ta sequence, soit tu utilises la taq la plus fidele que tu trouves pour ta premiere PCR, tu decoupes ta bande spe et tu t'en sert comme template pour une deuxieme PCR a 50 deg (mais bon si le fragment est gros tu vas avoir des risques de mutations, il faudra que tu sequences !)

A+

[inviteec077029]

quoi que tu fasse de toute façon l'amplicon non spé tu le feras pas disparaitre par contre pour amplifier ton amplicon d'interet tu peux faire varier la température d'hybridation tu commence à une th=54°C et tu finis à une th=68°C
Par contre tu dois retaper tout le programme sa sera long mais peut être utile. Voila mais c'est vrais que le plus pratique c'est que tu choisis des primers spécifique pense à les blaster et prend des primers avec la même tm

[MaliciaR]

Bonjour,

Et tu n'a pas obtenu ton amplicon specifique??

Non, justement Quand la T°C d'hybridation est à 56°C, je n'obtiens que l'amplicon non spécifique.

ca c'est pas bon, ca veux dire que ton amorce a 56 ne s'hybride pas suffisement sur ton site specifique pour avoir un rendement convenable, et que ton site non spe lui est tres tres bon

Beh oui, justement... Alors que je l'ai fait pour ce site et pas pour un autre et j'ai mis 8 pb en plus pour que l'hybridation soit assurée.

Honnetement, tu peux tenter 65 deg mais j'y crois pas trop.
Soit tu commande un oligo qui soit specifique de ta sequence, soit tu utilises la taq la plus fidele que tu trouves pour ta premiere PCR, tu decoupes ta bande spe et tu t'en sert comme template pour une deuxieme PCR a 50 deg (mais bon si le fragment est gros tu vas avoir des risques de mutations, il faudra que tu sequences !)

Je n'utilise pas de Taq, mais de Pwo. Elle est beaucoup plus fidèle, en fait.
Je me disais bien que les gènes humains me feraient suer, surtout que le clonage (quand j'aurai eu le fragment, évidemment ) sera avec NdeI...

quoi que tu fasse de toute façon l'amplicon non spé tu le feras pas disparaitre par contre pour amplifier ton amplicon d'interet tu peux faire varier la température d'hybridation tu commence à une th=54°C et tu finis à une th=68°C

C'est en gros ce que je pensais faire : partir de 60°C et finir à 70°C. Mais il faut que je regarde le %GC pour savoir où m'arrêter, non? Je ne suis pas sûre de savoir comment trouver la T°C pour la fin, en fait

Par contre tu dois retaper tout le programme sa sera long mais peut être utile. Voila mais c'est vrais que le plus pratique c'est que tu choisis des primers spécifique pense à les blaster et prend des primers avec la même tm

C'est une bonne idée, ça, les blaster

Merci, Gorben et Bacillus!

Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Franchement tu te compliques un peu la tâche
Si tes oligos amplifient fortement une bande aspécifique laisse tomber, ca va te pourrir.

Commences par prendre des oligos avec le même Tm, ça sera un bon début. Les différences de Tm que tu te traines vont vraiment te compliquer la vie.

Ensuite un petit gradient de température d'hybridation ne fera pas de mal pour déterminer à quelle température d'hybridation ta PCR est la plus spécifique.
(Par exemple il existe des thermocycleurs eppendorf qui font cela, tu dois pouvoir en trouver une dans ton labo non?)

Il font combien de paires de bases tes oligos? Sur quoi est ce que tu bosses? Y a des homologues? Des transcrits alternatifs? Parce que dans ce cas là, si tu veux être spécifique tu as intérêt à les aligner pour taper dans un domaine spécifique de ton gène.

Cordialement,
piwi

[MaliciaR]

Hello,

Commences par prendre des oligos avec le même Tm, ça sera un bon début. Les différences de Tm que tu te traines vont vraiment te compliquer la vie.

C'est vrai que c'est l'idéal

Ensuite un petit gradient de température d'hybridation ne fera pas de mal pour déterminer à quelle température d'hybridation ta PCR est la plus spécifique.
(Par exemple il existe des thermocycleurs eppendorf qui font cela, tu dois pouvoir en trouver une dans ton labo non?)

J'irai chez d'autres squatter leur thermocycler On n'en a pas, nous.

Il font combien de paires de bases tes oligos? Sur quoi est ce que tu bosses? Y a des homologues? Des transcrits alternatifs? Parce que dans ce cas là, si tu veux être spécifique tu as intérêt à les aligner pour taper dans un domaine spécifique de ton gène.

Le gène est Nod1. On va dire que Nod2 lui est très très proche... Concernant les transcrits alternatifs, je n'y ai jamais pensé; Ensembl pourrait me renseigner? La taille des amorces est quelque part dans mon b*rd*l au labo, donc j'en saurai plus dans 1h quand j'y serai

Je pense que c'est l'oligo down qui merde : c'est lui avec une Tm de 66°C et en plus il porte un tag hexa-His... Je ne sais pas si je pourrai trouver un endroit spécifique étant donné que cet oligo doit amplifier le Cter en ajoutant un tag His...

Merci, Piwi

Cordialement,

[piwi]

Tu veux le mettre dans quoi ton hexaHis? Y a un truc particulier ou tu veux juste faire un Tag. Parce que là une fois encore tu te fais suer pour par grand chose. Sais tu qu'il existe des vecteurs qui portent déjà le [His]₆ en N-ter?
Vas jeter un oeil du coté du Pet15 plutot que de t'ennuyer avec des clonages comme ça.

Si tu veux (dois) vraiment faire ce clonage toi même, je te conseille de procéder en deux temps plutôt que de tenter de passer en force.

1. faire un plasmide avec ton HisTag
2. Cloner ton fragment en phase

Note: je me félicite d'avoir trouver un mot différent à chaque fois que j'ai évoqué ton marqueur

Sinon pour ta molécule, oui, e! peut te renseigner plutôt deux fois qu'une. Toujours passer par e! avant de faire quoi que ce soit.

Sinon t'es en M1 non? Qu'est ce que tu fiches dans un labo de recherche un dimanche? Penses à te reposer.

[MaliciaR]

Tu veux le mettre dans quoi ton hexaHis? Y a un truc particulier ou tu veux juste faire un Tag. Parce que là une fois encore tu te fais suer pour par grand chose. Sais tu qu'il existe des vecteurs qui portent déjà le [His]₆ en N-ter?
Vas jeter un oeil du coté du Pet15 plutot que de t'ennuyer avec des clonages comme ça.

Si tu veux (dois) vraiment faire ce clonage toi même, je te conseille de procéder en deux temps plutôt que de tenter de passer en force.

1. faire un plasmide avec ton HisTag
2. Cloner ton fragment en phase

Note: je me félicite d'avoir trouver un mot différent à chaque fois que j'ai évoqué ton marqueur

In fine, je dois surproduire la protéine et la purifier et tout le reste qu'on fait dans un labo de prot'
Il me faut donc le tag hexa-His sur l'insert parce qu'ainsi la protéine sera produite avec. Je ne suis pas sûre de comprendre le pourquoi d'un tag hexa-His sur le plasmide, en fait

Sinon pour ta molécule, oui, e! peut te renseigner plutôt deux fois qu'une. Toujours passer par e! avant de faire quoi que ce soit.

C'est la première fois que je fais des trucs sur des non Procaryotes Alors, je n'ai pas trop le réflexe d'aller fouiller les banques spécialisées Eucaryotes, même si je connais un peu Ensembl! .

Sinon t'es en M1 non? Qu'est ce que tu fiches dans un labo de recherche un dimanche? Penses à te reposer.

Quand on aime, on compte pas les heures Je préfère y aller le we, je fais ce que j'ai envie de faire et il n'y a personne, alors je mets de la zic à fond et je peux chanter à tue-tête sans que ça tue quelqu'un

Merci beaucoup pour tes conseils, Piwi A très vite pour les détails!

Cordialement,

[piwi]

Pet15 est un plasmide d'expression qui possède un HisTag. Tu n'as plus qu'a cloner ton insert en phase dedans et le tour est joué. Ca évite d'avoir à réinventer la roue à chaque clonage.

[LXR]

Blaster des amorces avant une PCR c'est primordial! Surtout lorsque tu cherches à amplifier un membre d'une famille, donc où il y a de fortes chances d'homologies et de conservation de domaines entiers sur les ARNm en question!! Ca aurait été plus facile si tu faisais une qPCR, car avec le syBRGreen, on peut accéder à la spécificité des amorces avec des courbes Intensité = f (Température). En plus il y a des logiciels qui te calculent en 2 secondes les meilleures amorces compatibles et spécifiques (quoique des fois ça foire ). Mais tu fais de la PCR pure et dure....Bon courage!

Greg

[Yoyo]

salut
d'accord avec gorben et piwi, si t amorces ne marchent pas tu vas jamais t'en sortir!
c'est quand meme etonnant, c'est une region répétée? sinon moi je te conseille fortement d'essayer la Phusion vendu par Finzyme, elle est trop géniale cette enzyme! 10s par Kb, 3x plus fidele que la PFu, denaturation a 98°c etc...

Yoyo

[invitebe38ce14]

Salut,
un petit truc qui marche très souvent :
tu fais migrer ta première PCR,
sur une plaque à UV, tu piques ta bande d'interet avec un cone de 200microL
et tu te sers du pouillème d'agarose comme "matrice" pour une seconde PCR.
Tu n'auras alors plus que ton fragment comme matrice pour l'ampli,
l'inconvenient c'est qu'il te faut une polymérase très fidèle pour ces deux run de PCR (perso je serais plutot PrimStar)...

[piwi]

J'avais jamais pensé à ça. Ca a l'air plutôt pas mal

[Yoyo]

ah oui en effet, moi je "m'emmerde" a extraire l'ADN de l'agarose!
Ca marche donc meme avec un peu d'agarose? comment il en sort l'ADN de cet agarose?

Yoyo

[MaliciaR]

Hello,

Un gars du labo l'avait fait, mais il se plaignait des problèmes dus au BET... Du coup, ce qu'il fait c'est qu'il fait migrer deux fois la même chose, mais découpe le gel pour ne tremper dans le BET que l'une des copies de dépôt. Ensuite, il met les deux côte à côte et découpe avec un cutter Selon lui, ça marche 'achement bien.

Sinon, le gradient de T°C n'a rien donné. En fait, si : encore deux bandes aspécifiques Du coup, je teste toutes les polymérases intéressantes du labo avec et sans hotstarts... Ce soir sera le moment de vérité

En tout cas, merci beaucoup pour les conseils, très intéressants!

Cordialement,

[piwi]

encore deux bandes aspécifiques Du coup, je teste toutes les polymérases intéressantes du labo avec et sans hotstarts...

Je ne suis pas si certain que cela que tes bandes sont aspécifiques. Ce ne sont pas celles que tu attends, mais ça n'est peut être pas du bruit de fond, juste que tes oligos amplifient plusieurs choses au détriment de la bande que tu escompte. Surtout si les bandes sont bien nettes et intenses.

Sinon je ne vois pas l'intérêt de tester une tonne de polymérases. Tu amplifies un fragment de quelle taille? Parce que si c'est pas un truc qui nécessite une taq "long range" je ne vois pas ce que tu peux espérer. J'ai quand même fais quelques clonages et une taq commerciale classique a toujours fait l'affaire. Tu peux avoir un erreur de temps en temps mais y en a vraiment pas si souvent que cela si tu ne fais pas 40 cycles de PCR (pour un clonage c'est 20 cycles maximum pour moi).

[jmbowie]

Hello,

Un gars du labo l'avait fait, mais il se plaignait des problèmes dus au BET... Du coup, ce qu'il fait c'est qu'il fait migrer deux fois la même chose, mais découpe le gel pour ne tremper dans le BET que l'une des copies de dépôt. Ensuite, il met les deux côte à côte et découpe avec un cutter Selon lui, ça marche 'achement bien.

Sinon, le gradient de T°C n'a rien donné. En fait, si : encore deux bandes aspécifiques Du coup, je teste toutes les polymérases intéressantes du labo avec et sans hotstarts... Ce soir sera le moment de vérité

En tout cas, merci beaucoup pour les conseils, très intéressants!

Cordialement,

Moi aussi je fais mes purifs sur gel comme ton collègue Malicia. Je n'ai pas trop aimé la réflexion d'une chef du labo qui m'a dit "ha ouais, en fait tu fais au pif" :/
J'ai pas trop de mal à extraire l'ADN de l'agarose (purif sur colonne), mais c'est le rendement qui est chiant

[MaliciaR]

J'ai pas trop de mal à extraire l'ADN de l'agarose (purif sur colonne), mais c'est le rendement qui est chiant

Quel est ton rendement?
Je lui demanderai tout à l'heure quand il viendra. Je sais qu'on utilise un ladder où la bande à 1,6 kb contient 66 ng d'ADN pour 10 ul déposés. Du coup, ça te permet d'estimer la quantité de ce que tu as dans la bande et de là, le rendement après purif.

Cordialement,

[jmbowie]

Quel est ton rendement?
Je lui demanderai tout à l'heure quand il viendra. Je sais qu'on utilise un ladder où la bande à 1,6 kb contient 66 ng d'ADN pour 10 ul déposés. Du coup, ça te permet d'estimer la quantité de ce que tu as dans la bande et de là, le rendement après purif.

Cordialement,

Je saurai pas trop estimer, c'est variable. Aujourd'hui ca allait, j'ai pas quantifier, juste déposé et j'étais assez content.
Bon courage

[gorben]

Salut,

Ca marche donc meme avec un peu d'agarose? comment il en sort l'ADN de cet agarose?

95 degres pour 5 - 10 min en debut de PCR generalement l'agarose aime pas trop

Malicia, te prend pas la tete, commande d'autres oligos ou utilises ta premiere PCR en template... Tu vas jamais t'en sortir sinon

A+

[MaliciaR]

Malicia, te prend pas la tete, commande d'autres oligos ou utilises ta premiere PCR en template... Tu vas jamais t'en sortir sinon

A+

Beh... La Phusion que Yoyo a conseillée (avec le tampon FN) a donné juste ce qu'il me fallait Du coup, je ne m'emmerderai pas plus, ce sera le template et suite des évènements! C'est la Pwo qui merde parce que même avec de oligos "non problématiques" elle trouve à redire Donc, prête pour une journée de clonage, la Malicia

Merci pour vos conceils, vraiment!

Cordialement,

[Yoyo]

eh oui je l'avais dit, la Phusion y'a que ca de vrai
content que ca marche

Yoyo

[MaliciaR]

eh oui je l'avais dit, la Phusion y'a que ca de vrai

Tu as raison, oui Sinon, petite question : en fait, ça a marché avec le tampon GC et pas avec le tampon HF (comme j'avais dit plus haut). Le GC est censé être pour des fragments difficiles (c'est ce qui est marqué sur la brochure commerciale), mais pas d'explications supplménetaires. Je suis quand même assez étonnée de voir une bande de très forte intensité avec GC et rien du tout avec HF (même quantité de Mg²⁺ ). Une idée du pourquoi...?

content que ca marche

Yoyo

Merci pour le conseil

Cordialement,

[gorben]

Tu as raison, oui Sinon, petite question : en fait, ça a marché avec le tampon GC et pas avec le tampon HF (comme j'avais dit plus haut). Le GC est censé être pour des fragments difficiles (c'est ce qui est marqué sur la brochure commerciale), mais pas d'explications supplménetaires. Je suis quand même assez étonnée de voir une bande de très forte intensité avec GC et rien du tout avec HF (même quantité de Mg²⁺ ). Une idée du pourquoi...?

Oui, j'avais teste la Phusion en "beta test", c'est a dire avant commercialisation.
J'avais deteste cette enzyme, elle n'amplifiait rien du tout quelques soient les conditions testees. On en avait parle avec le service technique de la compagnie qui nous avait dit que enormement de retours de ce style leur etait parvenu, et qu'ils ne comprenaient pas pourquoi puisque dans leur labo elle marchait du feu de dieu !
Finalement ils ont trouve que leur enzyme etait tres mauvaise pour amplifier des fragments difficile et/ou a faible ou fort GC% (ce qui etait le cas de tous les retours negatifs). J'imagine qu'ils ont du faire le tampon GC dans cette optique. A l'epoque ou j'avais teste cette enzyme, elle n'etait fournie qu'avec un seul tampon !

A+

[jmbowie]

Oui, j'avais teste la Phusion en "beta test", c'est a dire avant commercialisation.
J'avais deteste cette enzyme, elle n'amplifiait rien du tout quelques soient les conditions testees. On en avait parle avec le service technique de la compagnie qui nous avait dit que enormement de retours de ce style leur etait parvenu, et qu'ils ne comprenaient pas pourquoi puisque dans leur labo elle marchait du feu de dieu !
Finalement ils ont trouve que leur enzyme etait tres mauvaise pour amplifier des fragments difficile et/ou a faible ou fort GC% (ce qui etait le cas de tous les retours negatifs). J'imagine qu'ils ont du faire le tampon GC dans cette optique. A l'epoque ou j'avais teste cette enzyme, elle n'etait fournie qu'avec un seul tampon !

A+

Je confirme qu'il existe un second tampon "GC buffer", que j'ai décongelé par erreur la dernière fois.

[MaliciaR]

Oui, j'avais teste la Phusion en "beta test"

Ah, les béta-tests... J'en ai fait pour Qiagen, ce qui m'a valu un thermos avec leur logo

J'avais deteste cette enzyme, elle n'amplifiait rien du tout quelques soient les conditions testees. On en avait parle avec le service technique de la compagnie qui nous avait dit que enormement de retours de ce style leur etait parvenu, et qu'ils ne comprenaient pas pourquoi puisque dans leur labo elle marchait du feu de dieu !
Finalement ils ont trouve que leur enzyme etait tres mauvaise pour amplifier des fragments difficile et/ou a faible ou fort GC% (ce qui etait le cas de tous les retours negatifs). J'imagine qu'ils ont du faire le tampon GC dans cette optique. A l'epoque ou j'avais teste cette enzyme, elle n'etait fournie qu'avec un seul tampon !

A+

Beh justement, ce fameux GC buffer... Je viens de relire et j'ai oublié de préciser ce que me sort Strider pour mon gène :

GC % = 58.18 100 * (c+C+g+G) / (a+A+c+C+g+G+t+T)

G/C skew = -0.0426 ((g+G)-(c+C)) / ((g+G)+(c+C))
A/T skew = +0.0560 ((a+A)-(t+T)) / ((a+A)+(t+T))

C'est ce qui a motivé ma question que j'ai très mal posée, shame on me

Cordialement,

[gorben]

Ils m'avaient rien donne pour mon test... a part quelques uL d'une enzyme qui marchait pas

Sinon tu donnes le % global rien ne signifie qu'il n'y a pas grosses regions riches AT ou GC ou de longues repetitions dans ta region a amlifier ou la pol va "paniquer"

A+

[MaliciaR]

Ils m'avaient rien donne pour mon test... a part quelques uL d'une enzyme qui marchait pas

Beh il m'a bien pris la tête, ce kit : je n'avais jamais les quantités attendues (et surtout dont j'avais besoin!) Mais j'ai été patiente

Sinon tu donnes le % global rien ne signifie qu'il n'y a pas grosses regions riches AT ou GC ou de longues repetitions dans ta region a amlifier ou la pol va "paniquer"

A+

Tu sembles avoir raison : il y a quelques petits endroits (qqs nucléotides, quoi) qui sont des pics : %GC > 75% ! Tu m'étonnes qu'elle "panique" Et c'est parfaitement reproductible, je l'ai refaite

Cordialement,

[piwi]

Séquencage obligatoire si tu as des zones à forts %CG. Les TAQ y perdent parfois peur petits et tu te retrouves avec une base en plus ou en moins. C'est pas trop grave pour un clonage pour faire une sonde. Mais pour l'expression de protéine c'est dramatique, tu peux te prendre un décalage de phase qui te pourri ton truc.
Donc même si tu as ta bande à la bonne taille méfiance méfiance. Ca m'est arrive une fois, une seule base... Les boules. J'ai déjà eu aussi le cas d'une base qui saute et une autre qui revient juste derrière et coup de bol je gardais ma séquence protéique native .

Courage!!!

[MaliciaR]

Séquencage obligatoire si tu as des zones à forts %CG. Les TAQ y perdent parfois peur petits et tu te retrouves avec une base en plus ou en moins. C'est pas trop grave pour un clonage pour faire une sonde. Mais pour l'expression de protéine c'est dramatique, tu peux te prendre un décalage de phase qui te pourri ton truc.

Je me suis demandée, en effet, si je devais être parano avec ce petit succès Visiblement, oui.
Surtout que c'est marrant : cette histoire de tampons m'intrigue vraiment. Je veux dire que j'ai fait 6 PCR, 2 avec chaque couple de primers et le tampon qui change. Ce que je vois, c'est qu'avec le même couple d'oligos, le tampon GC est toujours gentil et me donne ma bande, alors que le tampon HF ne le fait qu'une fois. Je suis plus confiante envers le résultat avec GC, évidemment, mais c'est tout de même curieux (je suis chainte, n'est-ce pas ).

Donc même si tu as ta bande à la bonne taille méfiance méfiance. Ca m'est arrive une fois, une seule base... Les boules. J'ai déjà eu aussi le cas d'une base qui saute et une autre qui revient juste derrière et coup de bol je gardais ma séquence protéique native .

Courage!!!

Merci beaucoup
Comme disait Louis (Pasteur pour les non intimes ) : La chance sourit aux esprits bien préparés.

Sinon, pour l'anecdote : j'ai changé 2/3 des trucs concernant le projet avec la transfo bizarre. Dont la moitié des primers. Et ô surprise : SIGMA a paumé ma commande