Immunodétection après production d'une protéine recombinante

[invitebe208abd]

Bonjour à tous,

J aurais besoin de votre aide concernant l interpretation d un resultat de western blot.

Lors d un TP nous avons transformé une souche E coli (rosetta) avec un plasmide recombinant afin de produire et purifier une proteine d interet. L expression du gene de cette proteine est sous la dependance du promoteur T7, et necessite ainsi l arn pol T7.
Afin de controler l expression, la souche comporte un plasmide exprimant du lysozyme qui degrade l arn pol T7.
Apres purification des lysats bacteriens (methode utilisée peu efficace) nous avons effectué un western blot.
Sur la membrane, on visualise la bande correspondant a la prot d interet, qlq detections non specifiques, et aussi une bande assez intense qui apparment serait le lysozyme, retenu de façon aspecifique.
Est ce possible? comment peut il etre retenu de façon aussi importante? A mon avis c est parce que le gene est apporté par un plasmide et donc en multicopie dans la bacterie, mais il n y a pas de raison qu il soit retenu lors de la purif???

merci de votre aide
-----

[invite17a570c1]

Bonjour,

Apres purification des lysats bacteriens (methode utilisée peu efficace) nous avons effectué un western blot.

Comment ça, peu efficace?

Sur la membrane, on visualise la bande correspondant a la prot d interet, qlq detections non specifiques, et aussi une bande assez intense qui apparment serait le lysozyme, retenu de façon aspecifique.
Est ce possible? comment peut il etre retenu de façon aussi importante? A mon avis c est parce que le gene est apporté par un plasmide et donc en multicopie dans la bacterie, mais il n y a pas de raison qu il soit retenu lors de la purif???

Attention, tu parles d'un Western blot! Tu parles donc de protéines. Pas de gènes à chercher dans un Western.
Si tu veux dire que le plasmide portant le gène codant pour la lysozyme est un plasmide multicopies et donc la lysozyme sera surproduite, c'est différent. Mais tes anticorps ne sont pas spécifiques de la lysozyme, si?


Cordialement,

[invitebe208abd]

En ce qui concerne la methode de purif...euh, disons qu on a pas fait bcp de lavage, c etait un peu à l arrache lol. On a bien vu le resultat, y a pas mal de detecions aspecifiques!!

Oui j ai fait un mauvais raccourci, je voulais dire que le gene etant apporté par un plasmide, il y en a donc plusieurs copies dans E Coli et une production plus importante de proteine lysozyme.

L anticorps qu on a utilisé etait dirigé contre HIS tag qui etait fusionné en Nter de notre prot d interet, voilà.

[invite17a570c1]

En ce qui concerne la methode de purif...euh, disons qu on a pas fait bcp de lavage, c etait un peu à l arrache lol. On a bien vu le resultat, y a pas mal de detecions aspecifiques!!

Mais vous n'avez pas saturé la membrane?

Oui j ai fait un mauvais raccourci, je voulais dire que le gene etant apporté par un plasmide, il y en a donc plusieurs copies dans E Coli et une production plus importante de proteine lysozyme.

Ce sont ce type de raccourcis qui te bousillent la note Donc, à éviter.

L anticorps qu on a utilisé etait dirigé contre HIS tag qui etait fusionné en Nter de notre prot d interet, voilà.

Quels sont les résultats des autres binômes?


Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitebe208abd]

Oui nous avons saturé la membrane, mais je pense que le fait d avoir utilisé un anticorps contre le tag et non contre la proteine explique en partie la detection d autres prot.
Tous les binome n ont pas utilisé les mm vecteurs et systemes d expression, mais certains ayant aussi utilisé un systeme comportant le plasmide pLysS (contenant l adn codant pour le lysozyme) detectent aussi une bande intense correspondant au lysozyme....bref, le soucis c est que je n arrive pas a l expliquer :-s

[invitebe208abd]

et j ai oublié de dire que j ai cherché la sequence du lysozyme, et elle ne contient qu un seul HIS....donc je ne vois pas comment cette proteine a pu etre retenue aussi

merci de votre aide

[invite17a570c1]

Y a-t-il un tag His incorporé dans ton plasmide pLysS?
Ou y a-t-il un enchaînement de plusieurs (6) His au sein de la séquence de ta protéine d'intérêt?

(J'ai horreur des Western blots, donc si je dis des bêtises, que quelqu'un me corrige ).


Cordialement,

P.S. Tu as parlé de la lysozyme au même moment que j'écrivais

[invite17a570c1]

Y a-t-il un tag His incorporé dans ton plasmide pLysS?

Shame, shame on me. J'ai fait un raccourci aussi
Je voulais savoir si ton plasmide portait une séquence de trinucléotides donant un tag hexa-His...

Sinon, des soucis avec votre anticorps? Puisque c'est reproductible Ou vous avez vraiment mal fait la purif', donc du coup il y a autre chose que l'anticorps reconnaît...


Cordialement,

[piwi]

Les résultats de l'expression puis de la purif ne sont pas toujours très bon avec un HisTag (et en général moins bon qu'avec un autre Tag). Les His sont chargées + et cela peut gêner la structure de la protéine puis sa stabilité. De plus en interagissant avec la protéine il peut ne pas être accessible pour la purification.
Du coup vous avez peut être une bande faible pour votre protéine d'intérêt devant la bande lisozyme.
Les contaminations sont faciles étant donné qu'il suffit que des protéines endogènes présentent un épitope contenant 6His. Ca n'est pas fréquent mais ça doit bien pouvoir se trouver (quelqu'un a déjà essayé de blaster 6His sur un génome de E.Coli? Je suis certain que l'on doit pêcher quelques trucs)

Cordialement,
piwi

[invitebe208abd]

Bonjour,

Tu as raison piwi jsuis d accord avec toi, le his tag ne permet pas une tres bonne purification, on a observé beaucoup de contaminants.
Mais ceci n explique pas comment le lysozyme a pu etre retenu de façon aussi importante, alors qu il n etait pas tagé et que sa sequence ne comporte qu une seule HIS...
je crois que je vais simplement dire que c est un contaminant qui est present en grande quantité du fait que son gene est apporté dans la bacterie par un plasmide

Merci encore a vous deux