Vérification transfert W.Blot

[invite0052996b]

bonjour,
question à priori simple, je voudrais savoir quel est le rôle de la vérification au bleu de coomassie des gels après transfert sur membrane. A priori cela permettrai de montrer qu'on a bien toutes les bandes sur gel mais j’comprends tjrs pas en quoi ça signifie que toutes ces bandes sont bien sur la membrane, puisque logiquement on ne doit voir sur la membrane que ce qui peut être révéler par l’Ac II. En fait comment savoir, dans le cas où l’on ne verrais rien via les AcII, que ça pourrais être lié au fait que la (les) bande(s) (pouvant être détectées par les Ac) sur gel n’aient pas été transferées sur le mb ? Une autre question. Je n'arrive pas à savoir parmis ces photos où sont les gels et où sont les membranes. Les 2 photos d'en haut représente les mêmes échantillons et ceux d'en bas représentent 2 autres échantillons sur gel et membrane. Le problème est qu'il y a des bandes partout lié a un pb d'Ac. J'aurais tendance à dire que les gels sont les photos où l'on voit au mieux toutes les bandes. merci
Image : http://zepload.com/images/1207486309_gel.jpg
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[Yoyo]

salut

colorier ton gel au bleu apres le transfert te permet de vérifier que toute les bandes qui étaient a l'origine dans le gel ont disparus et qu'elles sont donc sur la membrane.

YOyo

[invite0052996b]

D'accord mais comment fait-on pour savoir les bandes qu'ils y avaient au début dans le gel puisqu'on ne révèle qu'après migration. Tu veux p'te plutôt dire que ça permet de voir que les bandes sont là mais de moindre intensité,
comme sur les 2 photos à gauche? merci

[invite8c0cc995]

En fait quand on fait un western, on part du principe que pour des proteines de taille standard, si elle ne sont plus dans le gel apres transfert et coloration au bleu de coomassie, alors elles sont sur la membrane. Ceci est vrai si la polarité a été respectée durant le transfert, sinon les protéines sont dans le tampon et pas sur la membrane (mais dans ce cas, ce sont toutes les protéines).
Un autre test a faire est de colorer la membrane apres transfert au rouge ponceau (coloration transitoire qui disparait apres lavage dans de l'eau ou du PBS). Ceci te permet de vérifier que des protéines ont bien été transférées sur la membrane, de manière homogène, et qu'il n'y avait pas de bulles d'air.
L'utilisation d'un marqueur de poids coloré permet aussi de s'assurer immédiatement que le transfert s'est bien déroulé (i.e. que les protéines ont été transférées sur la membrane), mais ne montre pas que le transfert a été homogène sur toute la membrane à l'inverse du rouge ponceau.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Voici une réponse que j'ai donné à la question que ferrarinero m'avait déjà posé en PM:

Le coomassie permet de révéler toutes les protéines que tu as déposé. C'est une méthode de révélation plus sensible que le rouge ponceau mais en revanche la coloration est irréversible et empêche de faire un immunoblot derrière.
Donc si tu fais un coomassie sur ton gel ou sur ta membrane (ça marche pour les deux) tu peux dire adieu à ton western. Deux choses sont possibles.
Colorer le gel après le transfert histoire de voir si il y a encore les protéines dessus (et si il n'y en a plus prier pour qu'elles soient sur ta membrane). C'est pas la meilleur chose à faire.
La seconde solution est à favoriser. Tu mets deux membrane l'une sur l'autre pour ton transfert.

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gel--12
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La membrane 1 te servira pour l'immunoblot. En général, au cours d'un transfert tu as des protéines qui traversent et que tu perds. Tu vas mettre à profit ceci et la sensibilité du coomassie pour tester ton transfert.
Les protéines qui traversent la première membrane se fixent sur la seconde. Il y en aura peu mais tu pourras les voir au coomassie.

Sinon, si tu veux absolument contrôler le transfert sur ta membrane et faire un immunoblot derrière alors il faut passer au rouge ponceau dont je parlais plus haut. Le rouge ponceau est une coloration labile qui te permettra de faire ta réaction immunitaire derrière.

Voilou,
Cordialement,
piwi

[invite0052996b]

merci de vos réponses