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PCR quantitative en temps réel



  1. #1
    mannou2005

    PCR quantitative en temps réel

    Bonjour,

    J'ai un gène à étudier en PCRq en temps réel mais je trouve une difficulté de resultats qui sont presque l'inverse de tout les publications et j'ai essayé de voir si le problème vient de la sequence et la reponse c'était non.
    Si vous avez le moindre idée et si vous permettez de m'aider à trouver le problème pour le faire resoudre.

    Je vous remercie d'avance

    -----


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  3. #2
    piwi

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Vous n'avez peut être pas choisi le bon gène contrôle pour standardiser vos échantillons.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  4. #3
    IngDr

    Re : PCR quantitative en temps réel

    En complément de la réponse déjà donnée, au cas où, pour les calculs tu fais comment, car une simple erreur de signe de la calcul du delta Ct donne un résultat inverse ( 2==> 1/2; 4 ==> 1/4 etc...)

    Cordialement,

  5. #4
    mannou2005

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Bonjour,

    Je travaille sur le sang total et j'utilise le GAPDH comme gène de ménage.

    Cordialement

  6. #5
    mannou2005

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Bonjour,
    Ace niveau là il ya pas de doute car j'ai déjà fait avec une dizaine d'autre gènes et ça bien marché.

    A trés bientôt

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    IngDr

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Pour ce gène qui ne fonctionne pas comme dans la littérature, les amorces sont elles celle publiées dans la littérature ?
    Sinon :
    - ciblent-elles la même région du gène ?
    - absence de pseudogène ?
    - courbe de fusion OK ?
    - efficacité d'amplification correcte ?

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  10. #7
    mannou2005

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Bonjour,

    Je vous remercie pour tout conseils et je vais essayer de tester tout les hypothèses donnée.

    Vous m'avez vraiment aidé.

    Abientôt

  11. #8
    mannou2005

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Bonjour,

    Le fait de congéler les cellules mononucléees du sang 2 à 3 mois à -80°C et les cDNA 2 du même cellules à -20°V ca influe sur le resultat donnée par PCR quantitative à temps réel (taq man)? Si oui dont combien du temps maximal il faut garder notre materiel sans être abimés.

    Merci d'avance pour votre reponse.

    Cordialement

  12. #9
    mannou2005

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Desolé d'insister mais est ce que ma question n'était pas claire? En plus je suis nouvelle dans ce forum et j'essaye d'habituer au principe!!
    Cordialement

  13. #10
    IngDr

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Le forum n'est pas une hotline, donc les gens ne sont pas toujours dispo de suite, ni toujours dispo pour se lancer dans une longue explication.

    Les cellules au -80°C, c'est ce qu'il faut pour conserver dans de bonnes conditions. Pour les ADNc, au -20 ca peut aller, mais a condition qu'ils soient concentrés. Je m'explique. Bien souvent, pour la qPCR on fait une dilution au 1/10 des cDNA, et on décongèle le tube quand on veut faire une qPCR.
    De mon expérience, les ADNc dilués au 1/10 (à partir d'une RT sur 3ug d'ARN)
    se conserve moins bien que le stock concentré (ce qui est vrai pour bcp de composés biologiques). En outre, répéter des cycles de congélation/décongélation se révèle particulièrement négatif sur les qPCR.
    Donc un conseil : aliquoter les cDNA stock, et aliquoter les cDNA dilués,l'idéale étant de ne pas trop décongeler recongeler. Pour moi c'est plus cela qui va poser problème que la température de stockage.

    Cordialement

  14. #11
    piwi

    Re : PCR quantitative en temps réel

    A mon avis le mieux c'est d'aliquoter ses ARN et les conserver à -80°C. A partir de là tu peux reprendre un aliquote de ça pour faire tes cDNA pour l'ensemble de ta manip et rouler jeunesse. Tu fais tout assez rapidement et tu conserves tes cDNA (qui sont quand même assez stables normalement) à +4°C
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  15. #12
    mannou2005

    Re : PCR quantitative en temps réel

    Bonjour tout le monde et désolé de mettre la pression pour me faire repondre à mes questions mais c'était vraiment la première fois que je participe à un forum et je ne savais pas comment ça passe.
    Merci pour vos aide et abienôt.

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