Toujours problème de vecteurs...

[invite48206314]

Ce n'est toujours pas clair pour moi pour les transfections, les vecteurs etc...

Voici mon problème:

On veut identifier des NLS potentiels (transfert d'une protéine dans le noyau) le ou les fonctionnels.
on prend donc des cellules COS transformées par l'antigène T de sv40 et on transfecte par un vecteur d'expression portant l'ADNc de sequence des nls potentiels.
etude ensuite par immunofluorescence

Question: Pr etre fonctionnel le vecteur d'expression doit obligatoirement posseder:
A un promoteur fonctionnant dans les Cellules COS
B une origine de replication
C un signal de polyadénylation en 3' de la sequence de la protéine
D la sequence complète du gène de la protéine insérée en 3' du promoteur

=> Ok pour A et C vrai ainsi que D faux
Je ne sais jamais quand on doit avoir une origine de replication ou pas...

Merci d'avance (je crois que je n'ai pas été très clair)
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[invite563835f6]

Eh bien il me semble qu'une ORI est toujours nécessaire non? Comment veux tu obtenir plusieurs exemplaires de ton vecteur pour ton étude sinon?
Je n'ai pas beaucoup de notions en génie génétique, mais d'après ce que j'ai étudié, cette séquence est indispensable.

[piwi]

L'Ori est un minimum. Si il n'y en a pas ça n'est rien de plus qu'un bout d'ADN.
Un vecteur c'est un petit fragment d'ADN circulaire autoréplicatif.

Cordialement,
piwi

[Zellus]

Salut,

Ben comme je disais dans ton autre sujet "stabilité de l'ARNm", on utilise les plasmides non réplicatifs (sans origine de réplication, on appelle ça des plasmides suicide) surtout pour des études de régions régulatrices sur de courtes périodes.
Par contre pour produire une protéine en quantité suffisante comme dans ton cas, il faut une ori à ton plasmide.

PS : En même temps, est-il vraiment nécessaire d'avoir de la protéine en grande quantité pour faire de l'immunoflorescence ?

[A voir en vidéo sur Futura]