Q-CPCR encore !

[invite02cefc91]

Bonjour à tous !

Me voilà de retour avec mes questions de Q-PCR. là c'est plus une histoire de normalisation.

Je me pose la question, je souhaite comparer l'expression du gène A dans deux tissus (tissu 1 et tissu 2). Il se trouve qu'après extraction je me retrouve après plusieurs manips et une moyenne, une quantité d'ARN totaux dans le tissu 1 10 fois plus importante que dans l'autre.

Pour la RT, on normalise par la quantité d'ARN ok ! Pour la QPCR par la quantité d'ADNc ok !

Mais ma question est la suivante, après les résultats de Q-PCR, je trouve par exemple dans l'échantillon 1 le gène A exprimé 2 fois plus que l'autre, faut-il alors que je normalise par la quantité d'ARN total initiale ou cela n'est pas représentatif de l'expression ?



Merci de votre aide.



A plus
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[invite8c0cc995]

Si tu as utilisé la même quantité d'ARN pour les 2 RT, alors c'est que tu as bien un différence. Par contre si tu avais pris x ul de chaque échantillon pour faire la RT, alors la il faudrait normaliser par la quantité d'ARN utilisé.
L'idéal est de confirmer que tu as bien pris la même quantité d'ARN en quantifiiant aussi un gène de ménage (qui ne varie pas en fonction du traitement ou de la pathologie), et ce gène de ménage doit être au meme niveau dans tes 2 echantillons. Si ce n'est pas le cas, c'est que tu as : soit mal dosé, les ARN, soit mal fait les dilutions, soit que les ARN sont plus dégradé dans un échantillon, ou bien le gène n'est pas bon car variant. Dans l'absolu, l'idéal est de tester plusieurs gènes de ménage.
Maintenant une différence de 2x, c'est significatif si c'est reproductible, que tu as bien tenu compte de l'efficacité d'amplification de tes amorces (gamme de dilution en cascade).

Cordialement

edit : vu la différence de quantité d'ARN, as tu fait un gel d'ARN pour vérifier l'intégrité des ARN dans l'échantillon le moins concentré ? Y a t il un traitement à la DNase pour t'assurer que tu n'amplifies pas le génomique qui aurait pu cntaminer l'échantillon le plus concentré ? D'ailleurs les amorces chevauchent elles des jonctions exon/exon, pour éviter d'amplifier l'ADN ? As tu un controle sans RT (donc pour lequel il n'y a pas de cDNA et qui théoriquement ne doit rien donner en qPCR ?).

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

je suis d'accord avec IngDr. Si dans les RT tu as la même quantité d'ARN alors c'est bien que le gène A est plus exprimé dans le tissu 1.

IngDr a raison, tu peux vérifier tout ça avec un gène de ménage. Tu peux même le cloner dans un plasmide et ainsi déterminer un nombre de copies d'ADN par volume. Tu réalises ensuite une gamme et ainsi tu pourras poser des valeurs sur l'expression de ton gène grâce à la Q-PCR et ton gène de ménage.

[invite02cefc91]

Merci pour ces réponses.


Ma quantité totale d'ARN au départ dans chaque tissu, on sait qu'on observe ce genre de chose dans mon tissus.

Mais si je prend la même quantité d'ARN pour ma RT sachant que j'ai quand même plus d'ARN au total, il faut pas tenir compte de cette quantité.

je m'explique avec des chiffres :

Si par exemple, je prends 500 ng pour faire ma RT mais qu'au départ, j'avais une quantité d'ARN dans le tissu 1 de 2ug et dans le tissu 1 0.2 ug pour la meme masse de tissu, après mes résultats de RT-QPCR je ne dois pas tenir compte de cette quantité initiale ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite02cefc91]

Pour tout ce qui est contrôle, gène de référence, etc ... ça c'est ok, c'est juste cette quantité d'ARN initial qui me travaille.

Si avec la meme quantité d'ARN pour la RT, je trouve un gène 2 X plus exprimé dans un tissu que dans l'autre, il faut ensuite que je ramène à la quantité d'ARN initial dans le tissu pour avoir une idée réel du niveau d'expression et de la quantité non ?

[invite8c0cc995]

Tout dépend sur quoi tu veux normaliser : la quantité de tissu en mg, ou la quantité d'ARN extrait !
Si tu as un gène de ménage stable, il n'est pas faux de dire que ton gène d'intéret est 2x plus exprimé. Maintenant, je suis d'accord avec toi, on peut se poser la question sur la signification biologique car le tissu exprime peu d'ARN. Est ce du au type de tissu, à une plus faible densité en cellule, en noyau ? Y a t il bcp de graisse, de conjonctif dans ton tissu ?

[invite02cefc91]

Je travaille sur des plantes, sur des tissus de racines, et on s'est qu'on a un phénomène de dilution et de diminution de densité cellulaire en fonction de où on se situe.

Je pars de la même quantité de tissu, et j'ai des rendements d'ARN différents en fonction de je prélève mon tissu, et on sait que c'est normal. Donc je pense qu'il faut que je ramène le tout à la quantité d'ARN total.

Et c'est là que ca me pose problème. SI tu prends un gène qui est est autant exprimé dans 500 ng d'ARN dans deux tissus différents (avec les répétitions qui vont avec ..), tu dis que c'est un gène de référence, mais si tu ramènes ca à la quantité d'ARN total celui n'est plus un gène de référence bien qu'on soit à la meme quantité de matière.

Et je comprend pas pourquoi on ne tient pas compte de cette quantité initiale ...

[invite8c0cc995]

Je comprends ton problème, mais le truc, c'est que tu as moins d'ARN car tu as moins de cellules dans ton tissu, donc moins d'ARN. Or toi ce qui t'intéresse, c'est que savoir à quel niveau d'expression se trouve ton ARN dans une cellule donnée. Donc comparer ce niveau avec le niveau d'un gène stable, ou par défaut à une quantité X d'ARN (par ex la quantité d'ARN utilisé pour faire la RT), te permet de tenir compte de cette dilution des cellules. Ce qui est important, c'est la quantité d'ARN qui sera présent dans la cellule ou a eu lieu la transcription pour permettre une traduction, donc les tissus environnant, qui font de la masse, ne participe pas à ce phénomène. Il faut donc trouver un moyen de ramener ta valeur à une valeur représentative du nombre de cellules dans ton tissu, et cela tu l'obtiens en regardant le niveau de ton gène dans X µg d'ARN.

[invite02cefc91]

oué je vois ce que tu veux dire, je suis d'accord.

Je pourrais à la limite quantifier le nombre de cellules sur mon tissu. Maintenant il faut que je trouve une meilleur manière de tenir compte du phénomène de dilution.

Car juste prendre prendre la quantité d'ARN pour la RT à mon sens ne représente pas bien ce phénomène de dilution ...


En tout cas merci !

[invite02cefc91]

Donc en fait l'idéal serait que j'ai une idée du nombre de cellules présent dans mon échantillon pour pouvoir ramener ma quantité d'ARN total à un nombre de cellules pour vraiment voir ce phénomène de dilution....

[invite8c0cc995]

C'est ça, mais là c'est la quantité d'ARN qui peut te permettre d'y arriver.
Disons qu'une cellule produit une quantité R d'ARN en µg.
Dans dans 5g de ton tissu 1, si tu as 10^9 cellules, alors tu auras 10^9 R µg d'ARN
Dans dans 5g de ton tissu 2 si tu as 10^5 cellules, alors tu auras 10^5 R µg d'ARN.
La quantité d'ARN reflète bien la différence de nombre de cellules.
Mais, si tu t'intéresses au niveau d'ARN dans une cellule donnée, tu vas exprimer le niveau de transcription de ton gène par rapport à R. Comme tu ne connais pas R, tu vas utiliser un multiple de R (le même pour les 2 tissus pour que cela soit comparable), par exemple la quantité d'ARN que tu as utilisé pour faire ta RT. J'espère que là je t'ai fait comprendre que prendre la même quantité d'ARN pour les RT, et donc pour normaliser est correct

[invite02cefc91]

Je suis tout à fait d'accord avec toi, je vois ce que tu veux dire.

Encore faut il être sur que en fonction d'où je me situe, le tissu va produire la même quantité d'ARN ....

[invite8c0cc995]

Et oui ...
Au fait quand tu fais ton extraction, ce sont des ARN totaux ou des ARNm spécifiquement ? Si effectivement tes cellules expriment des quantités différentes d'ARN, faudrait voir la part des messagers par rapports aux autres, pour voir lors de ton dosage par spectro si des différences d'expression des ARNm influent bcp sur la quantité calculée. J'aurais tendance à dire que non, mais je ne suis pas un spécialiste des ARN. Tout ce que je sais, c'est que si j'induis la transcription de gènes cibles d'hormone dans des cellules en culture, je n'ai pas d'augmentation de la quantité totale d'ARN dosée au spectro, alors que par RTqPCR je vois une belle induction d'au moins une 10aine de gène.

[invite02cefc91]

Ben c'est la question que me je me posais, s'il ne serait pas intéressant de quantifier les ARNm pour voir leur proportion dans mes différents extraits d'ARN totaux ....

[inviteb6144ea4]

Et oui ...
Au fait quand tu fais ton extraction, ce sont des ARN totaux ou des ARNm spécifiquement ? Si effectivement tes cellules expriment des quantités différentes d'ARN, faudrait voir la part des messagers par rapports aux autres, pour voir lors de ton dosage par spectro si des différences d'expression des ARNm influent bcp sur la quantité calculée. J'aurais tendance à dire que non, mais je ne suis pas un spécialiste des ARN.

Je dirai la même chose. Les ARNm représente 3 % des ARN totaux donc je ne pense pas que ce soient eux qui fassent la différence. Une cellule peut exprimer beaucoup plus d'ARN qu'une autre si elle a une activité de synthèse protéique importante et que par conséquent elle se doit d'avoir beaucoup d'ARNr (80 % des ARN totaux) et ARNt (15 %).

[invite02cefc91]

Je suis d'accord mais j'aimerais quand même en être sur mais comme je suis déjà sur des échantillons très petites faire une extraction d'ARNm serait quasi non dosable ....

[gorben]

Salut,

En theorie, si ton (tes) gene(s) de menage est solide, tu n'as meme pas a quantifier l'ARN au depart puisque ton gene de menage va te normaliser tes resultats entre tes differents echantillons. En plus, c'est nettement plus precis qu'une quantification par la DO280 qui va quantifier a 95% des ARN stables et non pas des messagers. Je te laisse imaginer les variations que tu vas avoir si tu as ne serais ce que 10% de variation dans l'expression des ARN stables.


L'important c'est que ta RT marche bien, ensuite tout roule.

A+

[invite8c0cc995]

Salut,

En theorie, si ton (tes) gene(s) de menage est solide, tu n'as meme pas a quantifier l'ARN au depart puisque ton gene de menage va te normaliser tes resultats entre tes differents echantillons. En plus, c'est nettement plus precis qu'une quantification par la DO280 qui va quantifier a 95% des ARN stables et non pas des messagers. Je te laisse imaginer les variations que tu vas avoir si tu as ne serais ce que 10% de variation dans l'expression des ARN stables.


L'important c'est que ta RT marche bien, ensuite tout roule.

A+

Tout à fait d'accord avec toi. Perso je fais toujours les 2 car le gène de ménage me permet de voir que mes dosages sont stables, et à l'inverse, le dosage me permet de prouver que mon gène de ménage est relativement stable. L'idéal étant d'utiliser 2 gènes de ménages.

[invite02cefc91]

Mes échantillons étant très petits, je fais mes dosages d'ARN au nanodrop.

Merci en tout cas pour ces réponses et réflexions que ca m'apporte

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

si vous en avez un au labo, tu peux également passer tes échantillons au bioanalyseur.
Ce dernier te permet, comme pour le nanodrop, de doser tes ARN mais il permet également d'évaluer la QUALITE de tes ARN totaux. C'est très utile!!