Résolution gel d'agarose

[invite12bf6e4e]

Bonjour,

je viens vers le forum car je suis un peu à court d'idée pour mes gels d'agarose. je fais des électrophorèse pour séparer des fragments de restriction qui s'échelonnent de 800pb à 200pb environ mais je n'arrive pas à visualiser les bandes les plus petites, le gel semble déformé. mais ce qui est bizarre c'est que mon marqueur de taille est bien comme il faut. j'ai fait varier le pourcentage d'agarose entre 1.5% et 2.5% avec agarose classique ou haute résolution : rien ne change. j'utilise du TBE 0.5X. je fais migrer à 100V (j'ai essayé 50V mais toujours pas d'amélioration). je fais un bain de BET après l'électrophorèse (500µg/L).
alors on pourrait remettre en cause la digestion sauf que je vois bien mes grosses bandes et les petites sont là mais déformées ou à peine visibles.
voila si quelqu'un avait une idée du problème, je lui serais très reconnaissante.

merci
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[Zellus]

Salut,

Ce que je peux te dire c'est que je fais migrer les petits fragments de cette taille là dans des gels 1,5% à 100 V et ça marche plutôt bien donc je pense pas que ton problème vienne de là. Par contre, dans les labos où j'ai bossé on utilisais toujours du TBE ou TAE 1% donc 0,5% ça m'a un peu étonné mais bon c'est peut-être pas ça...

[invite12bf6e4e]

t'as peut etre raison : je vais quand meme essayer de faire avec du TBE 1X. c'est une idée qui me restait mais je me disais que ça n'aurait pas d'influence.
je verai ça demain
merci pour le tuyau

[piwi]

peut être aussi que vous ne mettez pas assez de digestion dans le gel. Les petites bandes sont souvent peu visibles, alors si vous êtes déjà faible pour votre 800 pb vous pouvez rever pour l'autre.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite12bf6e4e]

je l'ai pas dit dans mon message mais je vois très bien mes grosses bandes de digestion et les petites bandes du marqueur de taille. j'ai essayé de mettre plus d'échantillon et le résultat était le meme. là je suis en train d'essayer un nouveau bleu de charge car il pourrait masquer les petites bandes (d'après le labo). je croise les doigts.

[Zellus]

Euh oui "...TBE ou TAE 1X donc 0,5X..." et pas "...TBE ou TAE 1% donc 0,5%...". C'est à cause du gel lol.
Sinon bonne idée de piwi aussi oui .

[invite12bf6e4e]

c'est encore moi et mes gels!
voila j'ai essayé le tampon 1X mais ça a pas plu à ma cuve d'électrophorèse! elle s'est arreté en cours de migration (100v). si je mets du 0.5X ça va.
je sais plus quoi faire pour avoir une meilleure netteté de mes petites bandes. est ce que vous pensez que le fait que mon agarose soit périmée peut jouer un rôle sur la netteté du gel?
merci

[Zellus]

Salut,

Si ton agarose est périmé il vaut mieux le changer je pense oui car c'est peut-être de là que ton problème vient .
C'est étonnant que ta cuve se soit arrêtée. Elle a peut-être un problème elle aussi lol.

Cordialement,
Zellus

[invitec9f0f895]

Salut

Si tes bandes inférieures sont déformées lors de la migration, c'est a cause des sels utilisés pour la digestion!
Soit cette deformation ne te gene pas pour voir ton resultat et je te conseille e laisser tomber, soit c'est vraiment critique et la je te conseille de digérér une plus grosse quantité d'ADN, de passer la digestion sur une colone de purification (utiliser pour les PCR). et d'en deposer une quantité importante sur gel car en effet comme le dit piwi les petites bandes sont difficilement visibles.
Sinon en effet remplacer le bleu par un bleu migrant plus haut evitera de masquer ta bande.

YOyo

[invite12bf6e4e]

merci pour vos réponses. j'ai encore du boulot à ce que je comprends!!!
a bientot

[inviteb332a822]

c'est encore moi et mes gels!
voila j'ai essayé le tampon 1X mais ça a pas plu à ma cuve d'électrophorèse! elle s'est arreté en cours de migration (100v). si je mets du 0.5X ça va.
je sais plus quoi faire pour avoir une meilleure netteté de mes petites bandes. est ce que vous pensez que le fait que mon agarose soit périmée peut jouer un rôle sur la netteté du gel?
merci

Je ne crois pas que ça soit le 0.X ou 1X qui est en cause car, au contraire, le 0.5X est ce qui est recommandé par le fabriquant de cuve (c'est marqué dessus normalement).
à ta place j'essayerai:
- de préparer fraichement le gel (et non pas fondre un gel qui a été déjà préparé et solidifié, au cas où, sait-on jamais)
- faire attention à la concentration de BET (je ne sais comment tu visualises ton gel, si tu mets de BET dans le gel ou dans une solution après la migration), ça peut relativement masquer/demasquer des petites tailles.
- Comme on te l'a souligné, ça peut venir (avec la plus grande probabilité) de la quantité infime de ta digestion et/ou l'efficacité de(s) l'enzyme(s) de restriction utilisées.
- si ce que tu fais est de l'ordre de clonage classique, l'étape de digestion peut etre, à mon avis, négligé en faveur du séqunçage. On séquence et on vérifie si c'est le bon insert.

[inviteeba85d16]

Tous les conseil ont l'air bon.

Moi perso, je fait du 0.25X, à 200V. La migration est plus rapide, et mes résultats sont bon.

Que d'essais possibles.

[invite0345d784]

Trempe le bout d'un cone dans le BET et mélange le gel avec dès que tu l'as fait coulé. Essai aussi de changer de révélateur, souvent toute cette cuisine ne marche pas car les produits utilisés sont trop vieux ou ont été exposés trop longtemps à la lumière.