bonjour tout le monde, est ce que quelqu'un peut m'expliquer comment ça marche concrètement une expérience de dominant négatif? j'ai ma lignée cellulaire ou je veux "éteindre" ma protéine, je les transfecte à l'aide d'un plasmide contenant la séquence mutée? et je la trouve ou cette séquence et le plasmide? ça s'achète? ma question est peut être bête mais je n'ai jamais fais ça alors j'ai besoin d'éclaircicements, merci
Un dominant négatif est une protéine mutée empêchant la protéine sauvage d'assurer un de ses fonctions.
Un dominant négatif peut être par exemple une kinase mutée, et qui n'est plus capable de phosphoryler. Ainsi, elle peut toujours intéragir avec le susbstrat, mais celui ci ne sera plus phosphorylé. Le dominant négatif va entrer en compétition avec la kinase endogène et le substrat ne sera plus phosphorylé. Plus il y a de dominant négatif, moins il y aura de phosphorylation du substrat (c'est comme pendant les soldes, plus il y a de personnes qui veulent le même article que toi, moins tu auras de chance de l'avoir).
Pour le déroulement exacte d'une manip, tout dépend de la protéine que tu étudies (voie de signalisation, transcription, structure, etc...).
Où trouver un dominant négatif ? Soit il est déja caractérisé dans la littérature, auquel cas tu peux contacter le labo qui a publié pour avoir le plasmide, ou bien il est commercialisé, sinon, il faut le faire. La ce sera de la mutagénèse dirigée, mais concernant le site à muter, cela dépend de la fonction de ta protéine que tu souhaites "éteindre".
Sinon pour clarification, pour 'éteindre' une protéine comme tu le dis, des siRNA permette de supprimer la protéine complétement. Un dominant négatif ne fait que bloquer une fonction de la protéine, tout en la maintenant physiquement présente dans la cellule.
salut
dis tu te moques pas un peu du monde?
http://forums.futura-sciences.com/thread233688.html
pourquoi ouvrir une nouvelle discussion??
YOyo
