Bonjour à tous je voulais savoir comment marche la technique de dominant négatif et comment l'utiliser concrétement pour inhiber une protéine et est ce un K out ou plutot down c'est à dire avec quelle efficacité l'expression de la protéine peut elle être réduite? merci beaucoup pour vos réponses...
SAlut
en génétique un "dominant négatif" est un mutant perte de fonction qui "inhibe" l'activité de la protéine sauvage. Ainsi meme en présence de la copie fonctionnelle on observe le phénotype mutant.
j'ai du mal a comprendre ta question...tu pourrais etre plus claire?
YOyo
Alors tout d'abord merci pour cette réponse lol. En fait je voulais savoir si avec cette méthode on a 100% d'inhibition car par exemple avec la methode des si arn qui est aussi une technique de silencing on obtient pas 100% et on appelle ca knock down par rapport au knock out qui est l'invalidation de genes. Alors en fait si j'ai bien compris c'est au niveau génétique que ça se passe, on va modifier le gène de cette protéine de sorte que toutes les protéines produites seront non fonctionnelles donc on peut apparenter ça a un KO? mais comment fait on cette manipulation concrétement j'ai une lignée cellulaire qui surexprime une protéine et je veux l'inhiber pour en étudier les effets quelle est la marche à suivre au point de vue technique?
Bonjour!
Tu n'obtiendras jamais 100% d'efficacité et de silencing, mais c'est valable pour presque n'importe quelle technique/approche.
V.
Primum non nocere.
pour le Ko c'est très facile, mais il faut au premier lieu connaitre la séquence de gène qu'on veut excéser 'out' le dégager de génome.
puis chisir une enzyme de réstriction qui coupe de part et d'autre des extrimités de ce gène.
on ajoute une legase.
on fait une selection des KO positif soit dans une bactérie, ou directement par l'electrophorèse, puisque la longueure et le poid est réduit, ils facile à détecter.
et pour obtenir l'organisme KO il sufi d'introduire le génome ainsi obtenu dans un oeuf anuclié, et le lesser se dévlopé.
la majorité des organisme utilisé dans ce cas sont des souris
Bonsoir,
C'est beaucoup utilisé pour l'étude de protéines membranaires, notamment impliquées dans la transduction du signal.
En fait, tu transfectes tes cellules (qui expriment la protéine sauvage à leur surface) avec un plasmide codant pour cette même protéine mais qui est mutée (souvent il y a une délétion de la partie intracellulaire du récepteur ce qui empêche la transduction de se faire). Ta protéine va être largement surexprimée (d'où le terme de dominant) par rapport à la forme sauvage et les signaux extérieurs (ligand si c'est un récepteur, ...) vont reconnaître la protéine mutée qui est majoritaire à la surface de la cellule. Cependant, la cellule ne pourra pas répondre au stimulus vu que ta protéine est tronquée (d'où le terme négatif).
Cette technique revient donc un peu à empêcher l'expression (même si c'est pas le cas) de la protéine endogène, et tu vas ainsi pouvoir voir ce qui se passe lorsque ta protéine est "absente".
Les mutants dominants négatifs, les KO ou les RNAi sont employés généralement dans le même but, mais l'utilisation de telle ou telle technique peut dépendre de la protéine étudiée ou de l'organisme chez lequel tu travailles.
En espérant avoir été clair ...
Cordialement,
Zellus
oui c'est très clair merci beaucoup, juste une petite dernière est ce que cette technique de dominant négatif peut s'appliquer pour inhiber une protéine tyrosine kinase ou alors c'est plutot utilisé pour des récepteurs?
C'est utilisé pour down réguler tous les types de protéines mais surtout la signalisation en aval, je m'explique.Envoyé par ?chabou?
Un dominant négatif de GTPase (par exemple) va empêcher la GTPase d'être sous forme active (liée au GTP) mais elle ne va pas l'empêcher d'interagir avec ses effecteurs. Donc les effecteurs (qui fonctionnent normalement) vont se lier à une protéine sans activité catalytique et ainsi être titrés. C'est pour cette raison que l'on parle de "dominant " négatif : la protéine mutée inactive indirectement l'ensemble des éléments en aval car ils sont réquisitionnés par une protéine inactive et donc pas disponibles pour les protéines non mutées et fonctionnelles.
V.
Primum non nocere.
Non.
L'aspect de dominance n'a rien à voir avec la surexpression qui est un aspect purement technique (tout dépend du type de plasmide et donc du type de promoteur). A ce compte là dès que l'on surexprime un mutant c'est un dominant négatif... Le terme négatif vient au contraire du fait que ce type de mutant induit un phénotype muté à l'état hétérozygote (donc avec une quantité égale de protéines mutées et non mutées).
Un dominant négatif titre les effecteurs fonctionnels en aval en interagissant avec eux : ces effecteurs sont donc moins disponibles pour les formes actives restantes de la protéine (d'où la dominance en hétérozygotie).
V.
Primum non nocere.
merci à tous!!! lol
