Méthodes de dénombrement sur boite de Petri

[invite4acd3c79]

Bonjour,
Ma question va certainement vous paraître toute simple mais étant novice dans ce domaine, je pose quand même la question afin d'avoir les idées plus claires. Quelqu'un pourrait-il me faire un topo sur le dénombrement des colonies sur boîtes de Petri. Je m'explique. J'ai réalisé des boîtes de Petri où j'ai étalé 100µL d'une eau. J'ai réalisé trois boîtes de Petri distinctes. Au bout de 24 heures, j'ai un développement avec des colonies d'aspects différents. Le dénombrement peut-il s'effectuer avec distinction de ces colonies. Personnellement, je m'abime déjà les yeux juste en les comptant sans faire de distinction alors savoir combien il y en a d'une telle sorte ou d'une autre me paraît bien compliqué et non adapté. Donc est-il possible de faire du dénombrement spécifique ou alors avec une boîte de Petri on compte seulement le nombre total de colonies peu importe qu'elles soient différentes? De plus comment interprète t-on les résultats par la suite? Là, ça me donne un nombre de bactéries pour 100µL. Quelle est l'unité habituellement utilisée? Vraiment désolé pour tout ce nombre de question mais je n'ai pas accès à de livre où je suis sûre que tout cela est expliqué... Merci beaucoup d'avance!! Si vous avez d'autres infos à me donner auxquelles je n'aurais pas pensé et qui sont importantes, faites le moi savoir. Merci!!
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[invite17a570c1]

Hello,

Ce serait plus simple si tu nous disais si tu cherches à savoir si les proportions des différents phénotypes observés sont importantes. Puis, tu sais, tu peux faire autres choses pour te faciliter la tâche :
* diluer ton échantillon : mettre 10 uL échantillon + 90 uL LB, par exemple, si les 100 uL te donnent un tapis; si tu as une dilution du genre, tu peux avoir des clones isolés et plus rares que maintenant, ce qui facilitera le comptage;
* faire des quadrants : tu abaisses une droite verticale à partir d'un point au choix de ta boîte, puis tu fais tourner la boîte à 90° et tu traces une droite perpéndiculaire à la première. Si tu as fait ça de manière à ce que les densités de colonies dans chaque quart de boîte sont semblables, tu ne comptes que ce qui se trouve dans un quadrant et puis tu multiplies par 4
* au pire, si tu as beaucoup de colonies à compter et que cette activité sera régulière, tu peux demande à ton labo d'acheter un compteur Tu te crèveras encore un peu les yeux mais il comptera pour toi...


Hope that helps

[invite4acd3c79]

Re bonjour,
On va dire que c'est les seules manip' que je peux faire gratuitement hors de mon laboratoire donc je n'ai pas trop de moyens. J'utilise ce que l'on veut bien me donner, et j'évite d'abuser en en demandant trop... Si tu vois ce que je veux dire.
Donc pour le moment, j'ai juste trois boites avec des colonies dessus, faire la distinction, on va dire que c'est mort pour cette fois, j'ai pas envie d'y retourner passer mon aprem à me tuer les yeux... Mais j'aurais bien aimé avoir des infos sur l'expression des résultats???
Et pour ce qui est du comptage en prenant en compte les différences, c'est plutôt galère entre les blanches opaques à contour régulier, les blanches opaques à contour irrégulier et les petites blanches translucides, est ce que ça donne une idée du bazar que j'ai sur ces boites??? J'ai aussi des champignons qui viennent se rajouter et certaines qui semblent être plus orangées... La galère quoi, surtout quand au total j'en compte 150... Donc toute nouvelle info me sera utile!!! Merci beaucoup

[invitee863e61a]

Le LB ne coûte rien dans la budget d'un laboratoire, tu peux faire des dilutions (dans 1ml final) de 10 en 10 et déposer des gouttes de 200microlitres (3 pour chacun) puis compter.

Tu peux ensuite diluer de façon plus fine , de 5 en 5 par exemple, une fois que tu as cerné les dilutions auxquels tu comptes un nombre convenable (plusieurs dizaines) de colonies d'un type ou d'un autre

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6487dc7f]

Salut, plutot que de t'abimer les yeux pourquoi tu ne pas les laisse grossir plus longtemps? tu les laisse 48h au lieu de 24.
Sinon pour l'identification tu peux les observer sous un microscope.
Tu colore ton frotti au bleu de méthylène si tu peux pas faire de gram, tu saura au moins si c'est des bacilles ou des coques.
En plus tu peux utiliser des milieu séléctif, ca te permet d'avoir des suspitions sur les bactéries qui arrivent à pousser.

Avec tout ça tu trouvera pas l'espèce mais tu peux au moins avoir une idée de la famille.

[invite17a570c1]

Hello,

Je vois à peu près ton souci... Mais essaie de faire des dilutions jusqu'à ce que tu te retrouves avec des clones isolés rares. Puis, ça a un autre avantage : plus ils auront à manger, moins ils seront petits Du coup, tu pourras moins difficilement distinguer les pourtours lisses des pourtours dentellés. Tu essaies de faire quoi avec ces bactéries?

Sinon, Mrikzik, on ne peut pas trop laisser les colonies pousser : les bactos accumulent des métabolites et changent d'apparence, sans parler du fait que la taille des colonies change et que certaines peuvent arrêter de pouser plus vite que d'autres, ou que sais-je encore... Du coup, pour remarquer des caractéristiques phénotypiques de la colonie, tu n'es pas dans la m*rd*...


Bon courage

[invite7eb2285b]

Re bonjour,
On va dire que c'est les seules manip' que je peux faire gratuitement hors de mon laboratoire donc je n'ai pas trop de moyens. J'utilise ce que l'on veut bien me donner, et j'évite d'abuser en en demandant trop... Si tu vois ce que je veux dire.
Donc pour le moment, j'ai juste trois boites avec des colonies dessus, faire la distinction, on va dire que c'est mort pour cette fois, j'ai pas envie d'y retourner passer mon aprem à me tuer les yeux... Mais j'aurais bien aimé avoir des infos sur l'expression des résultats???
Et pour ce qui est du comptage en prenant en compte les différences, c'est plutôt galère entre les blanches opaques à contour régulier, les blanches opaques à contour irrégulier et les petites blanches translucides, est ce que ça donne une idée du bazar que j'ai sur ces boites??? J'ai aussi des champignons qui viennent se rajouter et certaines qui semblent être plus orangées... La galère quoi, surtout quand au total j'en compte 150... Donc toute nouvelle info me sera utile!!! Merci beaucoup

Salut Tam,

J'avoue ne pas trop comprendre ce que tu fais. Quel est le thème de ton étude? Juste l'identification ou le dénombrement des germes de l'eau? Tu veux faire tout ça en dehors de ton labo?
Il n'y a pas longtemps j'ai mis en culture de l'eau du robinet. Résultat: l'horreur. J'ai essayé d'identifier les différents phénotypes mais ai eu beaucoup de mal tellement il y en avait. Ce que je te conseille c'est de refaire chacun de tes étalements avec au moins 4 dilutions: pur, 10^-1, 10^-2 et 10^-3 par exemple. Ensuite tu regardes la boîte où les bactéries sont les plus faciles à compter et tu comptes. Pour le reste ça dépend de ce que tu veux faire. Ce que je te conseille c'est de commencer par dénombrer ton nombre de bactéries totales puis d'identifier l'ensemble de tes phénotypes. Ensuite si vraiment c'est nécessaire tu comptes par phénotype et éventuellement tu fais un ratio par rapport à la population totale. Généralement le compte est exprimé en nombre de bactéries / mL. Tu peux aussi observer tes boîtes sous une loupe binoculaire si tu en trouves une.

Voilà j'espère t'avoir éclairé un peu.

Bon courage et n'hésites pas si ce n'est pas clair.

[invitee863e61a]

Et n'oublie pas qu'avec ces techniques on ne détecte:
- pas que des bactéries (mais aussi des champignons microscopiques)
- que les organismes qui poussent sur ton milieu (même si c'est un milieu riche, il peut ne pas convenir à des organismes présents dans ton échantillon)
- des organismes qui forment des colonies en un temps relativement réduit (tout dépend de ton étude)