Détection des OGMs et PCR originale

[invite88442ff6]

Bonjour à tous,

Je suis actuellement en stage dans un laboratoire de biologie moléculaire et mon sujet de stage et le suivant :

Développement d’un système PCR original, relié à une puce à ADN pour l’identification des OGM dans les matrices agro-alimentaires

En fait je dois trouver un moyen de détecter 13 ogms de maïs différents à partir d'une même amplification. A l'heure actuelle 13 PCR différentes sont effectuées pour cela.
Je dois donc trouver une idée permettant l'amplification de chaque ogm d'un seul coup et la puce à adn servira ensuite de moyen de détection.
Pour le moment l'idée et de trouver une (voire 2 ou 3) amorces biotinylées pour amplifier les séquences ogms de façon linéaire et non exponentielle (pas d'amorce sens), de purifier les amplicons avec des billes magnétiques de streptavidine et de recommencer l'amplification à partir des amplicons et d'amorces RAPD.
Seulement j'ai beaucoup de mal à déterminer les amorces à utiliser et pour les amorces RAPD à savoir si elles sont judicieuses ou pas ?

Si quelqu'un a une idée pour que j'avance un peu, je suis preneuse !
-----

[invite17a570c1]

Salut,

Seulement j'ai beaucoup de mal à déterminer les amorces à utiliser et pour les amorces RAPD à savoir si elles sont judicieuses ou pas ?

Tu as beaucoup de mal, mais à quel niveau? Tu n'arrives pas trop à comprendre comment on fait une amorce...?
Si tu ne précises pas ta question, je crains que personne ne puisse t'aider


Cordialement,

[invite88442ff6]

C'est pour trouver des séquences communes aux différents ogms que j'avais du mal. Mon but est d'avoir une même amorce servant à l'amplification des différents ogms.
Finalement je vais grouper les ogm selon leurs points communs de construction et mettre 3 amorces, une pour chaque groupe.
Et on va essayer et on verra bien ce que ça donnera ! Et pour les amorces RAPD c'est pareil j'en ai trouvé deux sur internet et il faut qu'on teste par la pratique pour voir si elles sont efficaces.
Merci MaliciaR pour ta réponse

[piwi]

Ce qui m'inquiète un peu dans votre démarche c'est que j'imagine que vous allez utiliser des amorces dégénérées. N'est ce pas? Ne risquez vous pas de vous heurter à des amplicons aspécifiques à force de vouloir taper si large?

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite88442ff6]

En fait, en comparant les constructions de différents ogms, nous avons trouvé des séquences communes au niveau de promoteurs ou de terminateurs. L'important est qu'il y ait amplification des événements vers la sortie de la cassette ; nous avons donc choisi 3 amorces aptes à amplifier (nous l'espérons !) 3 ou 4 ogms chacune.
Chaque amorce sera biotinylée afin de purifier les amplicons obtenus puis nous ferons une 2ème PCR avec des amorces RAPD afin d'amplifier davantage.
Le risque d'obtenir des amplicons aspécifiques est présent, oui.
C'est un début d'idée pour améliorer la détection des différents ogms en une seule fois... Un tout début d'idée !

[gorben]

Salut,

Quel est l'interet d'avoir une PCR specifique puisque la puce de detection est deja specifique?
Le plus simple est de faire une PCR hexa6 puis d'hybrider la totalite sur ta puce... si ta puce est specifique, tu va avoir un signal qui va correspondre uniquement a ton OGM.

A+

[invite88442ff6]

Salut gorben,
Juste une question : Qu'est ce qu'une PCR hexa6 ?
Merci

[gorben]

Salut,

C'est une PCR avec des amorces degenerees, des hexanucleotides. Il existe aussi des kits pour des "whole Genome Amplification" qui marchent tres bien.

A+