Problèmes de polymérisation gels SDS PAGE

[invite79a402d4]

Bonjour,
je suis nouvelle sur le forum et actuellement nous avons un gros soucis avec nos gels SDS PAGE.On a une polymérisation incomplète (texture slim visqueuse).Ca m'était déjà arrivé et j'avais dans un premier temps mis en cause une erreur de manip.Puis j'ai refait le parcour et c'était pas ça j'ai donc incriminé le fond de la bouteille de TEMED qui présentait des impuretés.Aujourd'hui une autre technicienne a eu le même soucis mais elle a utilisé un TEMED neuf.On sèche totalement on a vu qu'il y avait des cristaux au fond de la bouteille de bisacrylamyde, cela se pourrait il que ça vienne de là.Merci par avance de vos réponses.
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[invite77749503]

Tu fais le gel de quel %,
Tu peux mettre la concentration et le volume que tu utilises ? et en quel ordre ?

[mantOs]

Tu fais tes mix acryl/bis toi même ?

Si c'est le cas, est elle vieille? Refais là, chez nous, les problèmes sont souvent liés à l'acryl .

[IngDr]

Si nécessaire, refaire la solution d'APS. Elle est stable 1 mois, après, il y a perte d'efficacité !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite79a402d4]

Tu fais le gel de quel %,
Tu peux mettre la concentration et le volume que tu utilises ? et en quel ordre ?

c'est un gel 12% j'ai oublié de préciser que c'est un proto éprouvé qui marche depuis un moment.On fait toujours pareil Acrylamide40%(je crois) 210mLBisacrylamide 2% 112mL Tris Hcl 1.5M 175mL SDS10% 7mL H2OmQ192.2mL Aps 10% 3.5mL TEMED 0.35mL.
Bien sûr on rajoute l'APS et le TEMED au dernier moment.Je fait mes solution d'APS pour 4 semain de manip et il est concervé au congélateur.De toute manière c'est sûr que c'est pas lui la cause puisque j'ai utilisé cette sauce (aliquots)4 semaines d'affilé et j'ai eu le problème 1fois.Ma collègue fait ses solutions d'APS extemporanément.Ke précise que nous ne somment pas des débutantes, on vois ou peut être le problème apparement la polymérisation est incomplète, mais c'est la première fois que je me trouve dans cette situation.

[invite79a402d4]

Si nécessaire, refaire la solution d'APS. Elle est stable 1 mois, après, il y a perte d'efficacité !

C'est pas ça ma collègue fait sa solution extemporanément moi j'en fait une pour 4 semaine que j'aliquote et que je congèle

[invite79a402d4]

Tu fais tes mix acryl/bis toi même ?

Si c'est le cas, est elle vieille? Refais là, chez nous, les problèmes sont souvent liés à l'acryl .

Oui mais on la fait au dernier moment.Par contre on c'est apperçu que dans notre bouteille de bis on avait des cristaux au fond.Serait ce lié?Est ce que quelqu'un a déjà eu se PB?On concerve notre solution au frigo.

[IngDr]

Penser à vérifier les pH (tampons, eau). J'ai eu un jour un tel problème, et après avoir tout testé, j'ai refait les tampons et ca a marché...
Faites vous les solutions d'acrylamide/bisacrylamide vous même à partir des poudres ?

[Effie]

Le mieux dans ce genre de situation est de:
-refaire toutes les solutions, comme les tampons
-utiliser des produits neufs, au moins pour ceux qui paraissent "suspects" (comme le bisacryl qui forme des cristaux; si la solution n'est pas homogène, tu ne peux pas être sûre de ta concentration)
- vérifier que l'un des produits ne vient pas d'un nouveau fournisseur (qualité ou concentration différentes du produit habituellement utilisé)
Si après ça marche de nouveau, tu ne saura pas forcément quel était le problème.... mais tu pourras reprendre tes manips!

[invite77749503]

Pour 12%, dans mon labo, l'acryl est à 30%,Biorad 7,2 ml, tamponB 4,5ml, H2O millipore 6,1ml,SDS 20% 90 µl,TEMED 20µl, APS 100µl pour 2 gels de séparation.
pour 2 gels de concentration
l'acryl est à 30% 0,8 ml, tamponC 1,5ml, H2O millipore 3,6ml,SDS 20% 30µl,TEMED 20µl, APS 36 µl.

on a jamais eu un problème de polymérisation. L'acryl est déjà prêt par le fournisseur, tout ce qu'on prépare c'est le tampon B, tamponC.
L'APS est gardé que 4 jours.

[invite79a402d4]

Penser à vérifier les pH (tampons, eau). J'ai eu un jour un tel problème, et après avoir tout testé, j'ai refait les tampons et ca a marché...
Faites vous les solutions d'acrylamide/bisacrylamide vous même à partir des poudres ?

Nous utilisons des tampons commerciaux donc assez fiable (d'autant que d'autres manip ont été faites en utilisant ce tampon sans soucis)
Non les poudres ne sont plus utilisées en france (enfin normalement).J'utilise des solution commerciales d'acrylamide et de bis mais je fait les mélanges au dernier moment.

[invite79a402d4]

Le mieux dans ce genre de situation est de:
-refaire toutes les solutions, comme les tampons
-utiliser des produits neufs, au moins pour ceux qui paraissent "suspects" (comme le bisacryl qui forme des cristaux; si la solution n'est pas homogène, tu ne peux pas être sûre de ta concentration)
- vérifier que l'un des produits ne vient pas d'un nouveau fournisseur (qualité ou concentration différentes du produit habituellement utilisé)
Si après ça marche de nouveau, tu ne saura pas forcément quel était le problème.... mais tu pourras reprendre tes manips!

Les solutions et les tampons sont "commercial" on va essayer de changer de bouteille d'acrylamide mais je pense pas que la concentration soit la cause de nos soucis.En fait le plus gros pb qu'on a c'est qu'on n'a pas le temps de tester tout les produits certains sont forcément hors de cause:
l'APS qu'on fait extemporanément ou qu'on congèle mais chacune a sa solution.c'est pas un pot neuf et le PB n'est pas systématique (c'est d'ailleur ce qui nous pose problème)J'ai fait 2 séries de 12 gels avec les mêmes produit la première série n'a pas marché (mauvaise polymérisation) dans 1 premier temps j'ai cru que j'avais fait une boulette mais j'en avais pas faite après vérif.J'avais donc incriminé le fond de la bouteille de TEMED.Entre temps ma collègue fait la manip avec une nouvelle bouteille de TEMED et ça marche.On c'est donc dit PB résolu.La semaine d'après je fais mes gels aucuns soucis , la même semaine elle fait les siens et rebelote!mauvaise polymérisation.
On utilise toujours le même fournisseur (reproductibilité oblige).
Et c'est là que je m'arrache les cheveux un PB est en général reproductible hors là il ne l'est pas!Je vais faire mes gels Lundi (en changeant le bis)mais même si ils marchent on ne saura pas si on a éliminé le pb.

[invite79a402d4]

Pour continuer la liste des hors de cause.
Le tampon qui a été testé
le TEMED bouteille neuve qui a marché
le SDS refait casi touite les semines et qui n'aurai de toute manière pas posé de PB
on retrouve donc nos solution d'acry et de bis

[invite79a402d4]

Pour 12%, dans mon labo, l'acryl est à 30%,Biorad 7,2 ml, tamponB 4,5ml, H2O millipore 6,1ml,SDS 20% 90 µl,TEMED 20µl, APS 100µl pour 2 gels de séparation.
pour 2 gels de concentration
l'acryl est à 30% 0,8 ml, tamponC 1,5ml, H2O millipore 3,6ml,SDS 20% 30µl,TEMED 20µl, APS 36 µl.

on a jamais eu un problème de polymérisation. L'acryl est déjà prêt par le fournisseur, tout ce qu'on prépare c'est le tampon B, tamponC.
L'APS est gardé que 4 jours.

Se sont les produits que j'utilisais dans mon précédent labo également.Mais là c'est pas possible (imagine le cout on utilise presque 1 Lde bis et 1.5L d'acryl par mois).personne a donc eu se soucis .Je pense a contacter le fournisseur déjà pour lui demander si la présence de petits cristaux est "normale" et ensuite pour savoir si sur ses lots il n'a pas eu de retour suite a des soucis.