Crossing threshold

[invited7732010]

Bonjour,

Voilà, nous avons fait un TP avec des PCR et je voudrais analyser mes résultats mais je comprend pas à quoi correspond le Ct (crossing treshold), on parle aussi de bruit de fond ??et je voudrais aussi savoir comment on quantifie une efficacité de PCR, j'ai cru comprendre avec la fluorescence gràce au SYBRgreen mais vu que le SYBRgreen ne se fixe qu'entre 2brins d'ADN il faut faire la mesure de fluorescence avant la dénaturation de ces brins, c'est ça? Et pourquoi sur la courbe obtenue il y a un seuil, y a plus assez de bases pour continuer l'amplification?
Merci d'avance
Marjorie
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[invite8c0cc995]

Je te renvoie à une discussion que nous avons déjà eu sur le forum, et dans laquelle j'ai posté un fichier de synthèse sur la quantification.
http://forums.futura-sciences.com/bi...ntitative.html

Pour les autres questions : le Ct, c'est le cycle à partir duquel le signal est supérieur au bruit de fond de fluorescence, donc le début de la phase exponentielle. Le bruit de fond, c'est la fluorescence de base du sybr green, l'autofluorescence des molécules dans ton tube réactionnel, le bruit de fond électronique, qui font qu'au départ, la fluo n'est pas nulle.
La prise de fluo avec le Sybr se fait à la fin de la phase d'amplification à 72°, donc quand tout est double brin.
Apres un certains nombre de cycle, la polymérase se dénature, il y a de moins en moins de primer, de dNTP, et lors de l'incorporation des dNTP, il y a production de pyrophosphate qui inhibent la PCR, donc on arrive à une phase plateau.

[invite8c0cc995]

Precision : on parle de Crossing point (Cp) ou Threshold Cycle (Ct)