Western sur protéine membranaire
Bonsoir
Je cherche a effectuer un western sur un extrait de protéine de levure (donc difficile a casser). cette protéine a la particularité d'etre accrochée et retenue a la membrane vacuolaire (ainsi qu'au RE).
Si quelqu'un a un protocole pour les proteines membranaires je suis preneur.
YOyo
Je fais tous mes western sur une protéine membranaire (mais de cellules humaines et pas de levure) en Laemli (je n'ai jamais su l'écrire) ou d'autres tampons style Guanidium, urée, RIPA,... Ca ne marche pas le Laemli chez la levure??? Est ce que tu as essayé de casser au dounce?
V.
Je n'ai pas la réponse à ta question ne bossant pas sur ce type de protéines mais est ce que tu as jeté un œil sur protocol-online.org? (C'est pas une blague)
Sinon tu n'as pas essayé de purifier tes fractions par centri et de passer ça au sonificateur? Même question que Vinc, si c'est juste pour un WB. Tu peux peut être fractionner et passer ta fraction au Laemmli bouilli?
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Salut
Merci, je n'ai pas encore essayé, mais si le laemli marche chez la levure, mais je pensais qu'il fallait au moins un detergeant pour solubiliser la proteine afin qu'elle ne reste pas dans le culot de debris.
Yoyo
Il y a du SDS dans le laemmli. Et puis tu fais bouillir... La gueule des membranes après cela!
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
merci! j'essaye demain on verra bien ce que ca donne
En plus je suis meme pas sur d'arriver a voir a protéine ...
Yoyo
Oui oui ca devrait marcher sans problème (et sans fractionnement) en laemli
V.
Salut,
Perso j'ai toujours utilise ce protocole pour mes proteines membranaires (bacterie, gram -) :
1/resuspension dans de l'eau
2/sonication
3/centri pour virer les debris
4/ajustement a 1ug/ul dans le laemmli et boil 10'
Toujours eu des resultats nickels !
Maintenant j'utilise la precipitation au TCA. Apparement ca precipite vraiment TOUTES les proteines. C'est beaucoup plus simple que la sonication, et en plus tu evites les degradations. Par contre j'ai jamais essaye specifiquement pour des proteines membranaires.
A+
Merci beaucoup pour vos précisions.
J'avais prévu d'utiliser le TCA j'ai un protocole qui marche tres bien pour les protéines cytoplasmiques. Je vais faire le laemli en parallele et on verra bien ce que ca donne
YOyo
