WB, GFP et imageur fluo

[invite8135ca60]

Bonjour à tous, j'ai une petite question pour les pros du WB.
Je bosse sur une prot taggée GFP et depuis peu on a un imageur à fluo(typhoon) pour révéler les mbs.
J'voulais savoir s'il est possible de reveler directement la gfp (sans AC primaire et secondaire), avec l'imageur!
On me certifie que c'est possible (mais les gens n'ont jamais essayé), j'ai essayé une ou deux fois sans succès et comme ce n'est pas trop mon domaine et que je ne blot pas tout les 4 matins je n'ai pas trop le temps (ni le materiel biologique) pour mettre au point surtout que je ne sais pas si la gfp continue d'etre fluo après denaturation (c'est çà la vraie question).

Donc voilà le pb, pensez vous que ça serve à qqch que je réessaie de la révéler comme ça ou c'est impossible.
Merci
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[gorben]

Salut,

Je doute que la GFP denaturee soit encore fluorescente. De toute maniere, meme si elle l'etait il faudrait que ton systeme soit capable d'exciter a la longueur d'onde de la GFP, et de capter a une autre longueur d'onde. Ca se verifie facile dans les proprietes de ton imageur (c'est soit des filtres, soit un laser). Mais honnetement, n'y crois pas trop.

A+

[Zellus]

Salut,

Ca me semble aussi peu probable que ça marche vu que la GFP va être dénaturée. Par contre il me semble qu'il est possible de faire des WB à partir de gels natifs mais je suis pas très sûr. Si quelqu'un en sait plus ...

[invitec9f0f895]

SAlut

en effet ca ne marchera pas en conditions dénaturante. DOnc deux possibilités:
- Soit effectuer une renaturation de la protéine (dialyse contre un tampon non dénaturant.
- soit faire un gel non énaturant, mais la il risque d'etre difficile d'évaluer la taille des protéines, celles-ci ne migrant plus en fonction de leur poid moléculaire.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8135ca60]

Merci pour vos réponses,
j'me doutais que la gfp dénaturée ne fluorescée plus.
Pour ce qui est de faire un gel en condition non dénaturantes je n'y avais pas pensé mais le pb c'est que ma prot est assez lourde (220kDa et 210 kDa en comptant le tag) et membranaire.... Du coup j'crois que je vais retourner à mes anticorps et mon ecl!

Si qqun pense que le wb sans dénaturation est possible, je suis preneur pour un protocole (si il y a des trucs qui changent à part la denat).

[invite02cefc91]

En tout cas, moi je confirme que la GFP peut être révélée par ton système d'imagerie !

Ca marche même sur des plantes transgéniques GFP que tu places directement dedans !

[Zellus]

Ca marche même sur des plantes transgéniques GFP que tu places directement dedans !

Oui d'accord mais là la GFP n'est pas dénaturée.

[invite02cefc91]

Ah oui je sais. C'était juste pour dire qu'avec son système révéler la fluorescence due à la GFP c'est possible

[Zellus]

Ah ok j'étais pas sûr que c'était ce que tu voulais dire. Autant pour moi .