Clonage d'adn génomique; aidez moi à raisonner en vrai généticien.
bonjour, je ne comprends pas trop le principe du clonage d adng, en particulier comment on crée une banque d adn genomique.
J ai un exercice à rendre là dessus, et malgrés mes problèmes de compréhension j essaie de le rédiger au mieux, ceci dit la note de ce devoir est si importante pour l obtention de mon diplôme que je vous appelle au secours pour me corriger ou me reprendre si j ai mis des réponses érronées...
J ai donc besoin de vos lumières...
voici le sujet de mon devoir:
afin d etudier le génome d une bactérie que l on sait cultiver on en prépare une banque d adn génomique dans le plasmide pbr 322.
Le tableau 1 donne les caractéristiques de quelques enzyme de restriction.
question
décrivez les différentes étapes de la construction de la banque en précsant les enzymes de restriction utilisées, ainsi que les conditions de digestion.Justifiez tous vos choix
voici ma réponse (celle que je vous demande de corriger)
1° préparation de l adn à insérer
extraction de l adn génomique (dois je mettre comment et si oui je ne sais pas trop lyse de la cellule, et recupération de l adn pa précipitation???)
fragmentation de l adn de façon à obtenir des fragments de taille homogène (digestion très ménagée par une enzyme de restriction qui coupe souvent et qui génère des extrémités cohesives).
Ici on utilisera bamhi car elle coupe tous les 4kb et que c est l enzyme que l on utilisera pour linéariser le plasmide pbr 322.
2 réalisation d un recombinant
linearisation des plasmides , avec la même enzyme que celle utiliser pour fragmenter l adn g.
La digestion des plasmides doit etre complète (tous les plasmides doivent être linéarisés).
Afin de pouvoir selectionner les bactéries ayant reçu des plasmides recombinants on utilisera bamhi car elle coupe le plaspmide au niveau d un gene de resistance a la tetracycline.De plus bam HI va générée des extrémités cohésives compatibles a celle généree lors de la fragmentation de l adn (par bamHI egalement).
pour ne pas que le plsamide se relinearise on fait agir une dephosphorylase qui va generer des ext 5'OH.
on met en contact les plasmides et l adn g à cloner, on doit avoir un fragment d adn g par plasmides donc on respecte les proportions 50% adn g 50% de plasmides...
le plasmide recombinée est refermé par une ligase.c est la ligation.
3) incorporation a l hôte et amplification
incorporation du plasmide dans une bactérie ou une levure par electrophorese ou grace qu cacl2 (comment j ai pas bien compris, je crois que ca se fait tout seul par choc electrique de electrophorese!!!)
amplification
Le plasmide va se multiplier indépendamment de son hôte,
de plus en presence de clhoramphenicol le chromosome bactérien est a controle relaché (je sais pas trop ce que ca veut dire !!), cela va donc permettre l accumulation des plasmides dans la cellule bactérienne.
nb le vocabulaire est il bon???
N ai je rien oublié???
Est ce vraiment ça, j ai bien revu le cours mais certains points certainement considéré comme acquis ne sont pas très détaillé dans mon cours...
Aidez moi s il vous plaît c est un devoir tres important
merci a tous
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