Aide sur la qPCR

[inviteafc350b4]

Bonjour tout le monde!
Je suis actuellement en stage et on m'a demandé de faire quelques recherches; seulement, ça fait 3 jours que je suis dessus et je n'ai rien trouvé de très concluant, pour ne pas dire rien du tout...
Voici les questions que je me pose:
- quelle quantité faut-il d'ARN au minimum pour réaliser une RT-PCR?
- pendant combien de temps peut-on conserver les plaques PCR à 4°C?
- quel est l'impact de la dégradation des ARN sur la qPCR? Se fait-il fortement sentir?
- existe une bonne publication sur le touchdown? sur les techno qPCR?

Je sais que c'est beaucoup de questions, mais je ne trouve vraiment rien, peut-être n'ai-je pas cherché au bon endroit, mais bon.
Je vous remercie d'avance!
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[inviteafc350b4]

Euh, pour la quantité minimale d'ARN j'ai trouvé 3µg, mais je ne l'ai trouvé qu'une fois. Cette quantité vous paraît-elle raisonnable?

[Zellus]

Salut,

quelle quantité faut-il d'ARN au minimum pour réaliser une RT-PCR?

Moi quand j'ai fait de la PCR en temps réel en M2 on partait de 1 µg d'ARN pour faire la transcription inverse. C'est largement suffisant vu que tu n'as besoin que de quelques ng d'ADNc pour la PCR.

pendant combien de temps peut-on conserver les plaques PCR à 4°C?

Je ne sais pas vraiment mais je pense que ça doit pouvoir se garder plusieurs jours. Après, vaut mieux les garder à -20°C si possible.

quel est l'impact de la dégradation des ARN sur la qPCR? Se fait-il fortement sentir?

Moins d'ARN donc moins de signal en PCR donc le risque est de sous-estimer la quantité d'ARN dans la cellule.

existe une bonne publication sur le touchdown? sur les techno qPCR?

Je n'ai rien à te proposer pour la PCR touch-down, mais pour la PCR en temps réel tu as par exemple cet article. L'inscription à Biotechniques est gratuite.

[piwi]

On peut faire un petit décompte rapide.
Je fais mes RT avec 1µg d'ARN que je reprends dans 200µl finaux. Dans chacun de mes puits de PCR je mets 2,5µl de RT soit 12,5ng d'ADNc
Le rendement de la RT n'est certainement pas optimal donc en réalité je mets bien moins dans mon tube PCR.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteafc350b4]

Merci bien pour vos réponses!