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Sollution tampon votre avis



  1. #1
    wari

    Sollution tampon votre avis

    Bonjour,
    Je veux faire le dosage d’une enzyme (acétylcholinéstérase) chez un gastéropode, je cherchais un tampon pour la préparation du tissu ; je veux faire le dosage au niveau de la glande digestive et au niveau du pied.
    J’ai trouvé quelqu’un qui a utilisé le tampon suivant chez un gastéropode du même genre, (mais ce n’ai pas la même espèce).

    Samples were homogenized in a Tris buffer (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, 0.1 mM antiprotease cocktail,1 mM DTT [dithiothreitol]) in a 1/5 w/v (weight / volume) ratio, using a Potter–Elvehjem glass homogenizer fitted with a teflon pestle. The homogenates were then centrifuged for 25 min at 9000 _g. All procedures were carried out at 0–4 8C.

    Ma première question est la suivante :
    Est ce que pour ce tampon a la bonne osmolarité de l’espèce que je veux utiliser ? J’ai entendu dire que généralement ces tampon ont une osmolarité proche de 300, que c’est à peu prés l’osmolarité des cellules vivante ?
    Ma deuxième question est la suivante :
    Est-ce que les composantes de ce tampon ne risque pas de réagir avec celle du tampon que je vais utiliser pour le dosage de l’enzyme (le tampon que dicte le protocole du dosage de l’acétylcholéstérase, destiné à offrir un pH idéal pour la réaction). Ne risque t’il pas de réagir aussi avec la acétylcholine que je vais préparer et le DTNB (l’enzyme doit dégrader l’acétylcholine pour donne du thiocholine qui va ce lier au DTNB et le spectrophotometre va mesurer l’absorpition du produit thicholine-DTNB).
    Est-ce que on prend tout ça on compte en fabriquant un tampon ?
    Les gens qui on utilisé ce tampon, ont ,aussi, fait le dosage d’autres enzymes existant dans cet homogénat préparé avec ce tampon. Il l’on utilisé pour la préparation des glandes digestives et aussi le pied du Gastéropode.
    Est-ce que c’est juste d’utiliser le même tampon pour la préparation de l’homogénat de tissus issus de différents organes ?
    Comment fait’ on pour préparer un tampon idéal et faire le choix pour ces composantes ?
    Merci beaucoup.

    -----


  2. #2
    Fabien31

    Re : sollution tampon votre avis

    Bonjour Wari

    Bon je ne suis pas spécialiste des gastéropodes ou de l'acétylcholinestérase mais je vais essayer de t'apporter un peu quelques éléments de réponses.

    Le tanpon que tu souhaites utiliser est un tampon d'extraction donc pour moi le plus important c'est qu'il te permettes d'extraite ta protéine avec un rendement maximal et tout en gardant l'activité de ta protréine. La composition que tu as donné me parait classique.

    Ce que je pourrai te conseiller c'est de faire le tampon avec la composition que tu as fourni et d'en faire un second avec NaCl 300mM.
    Ensuite fait une étude comparative entre les deux (SDS-PAGE pour regarder la quantité de ta protéine et southernblot si tu as un anticorps et fait également ton test d'activité avec les deux extractions et regarde si tu vois des différences).

    Par contre si tu as la possibilité de connaitre (théoriquement ou expérimentalement le point isoélectrique) je te conseille de vérifier que le pH de ton tampon soit différent du pI.

    Ensuite concernant ta seconde question. Difficile a répondre sans connaitre ton protocole expérimental (composition tampon, volume tp vs volume extrait enzymatique, ...). Peux tu me donner quelques élements de réponses si ce n'ai pas trop confidentiel ? Mais sache qu'il existe des méthodes pour changer de tampon après ton extraction pour conditionner ta protéine dans un autre tampon !!! (Dialyse, unité de concentration, ...)

    Par contre j'ai une question pour toi : Lorsque tu auras extrait tes protéines, comment comptes tu procéder, tu vas immédiatement faire ton dosage enzymatique ou vas tu conserver ta protéine à -20°c ? Car si tu choisis la seconde option, il faudra que tu tiennent comptes de d'autres paramètres absoluement important !!!!

    Bon courage

    Fabien

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