Bonjour,
j'aimerais savoir si les PCR sur colonies pour faire vérifier si le clonage est bon est une bonne alternative par rapport au miniprep?
C'est la première fois que je fais sa et le résultats est négatif sur 20 colonies
Qu'en pensez-vous?
m'arrêtez là ou bien faire comme même des minipreps derrière?
Personnellement, j'ai déjà fait des PCR sur colonies sans difficultés.
Tu piques avec un cure-dent dans ta colonie, tu le le trempes dans ton mix de PCR et tu agites un peu.
Normalement sa fonctionne bien.
Quel protocole as-tu utilisé pour ton clonage, es-tu sur que ta sélection fonctionne bien ?
j'ajouterai juste que si la PCR est positive, il faut tout de même faire ensuite une miniprep et un séquençage. La PCR sur colonie n'est qu'une méthode rapide de screening rapide qui te premet de vérifier la présence de ton gène.
J'essaye de faire un TA cloning d'un insert (1500pb) dans un vecteur pcDNA3.1 je fais des PCR sur colonies à l'aide des amorces qui m'ont aidé à amplifier le cDNA donc je m'attend à une bande d'environ 1500pb mais à la place de sa j'ai une bandes d'environ 200pb sur presque tout mes clones !! contamination? ou bien insertion d'un produit non spé? pourtant j'ai bien découpé et purifié mon produit PCR
J'ai également essayée d'inserer le même insert dans un autre vecteur le pdrive de qiagen (TA cloning) j'ai fait du screeming blanc/bleu je pique uniquement les colonies blanches et résultats pas d'insert à 1500pb mais à 200pb
????
As-tu fait migrer ton premier produit de PCR, celui qui t'a servi à faire le clonage ? est-ce qu'il est de 1500 ou 200 pb ? l'as-tu séquencé ?
Je suivrais ce protocole :
-Amplification du gène avec des amorces fanquées de sites de restricition différents
-migration du produit de PCR, purification et séquençage
-digestion du produit de PCR et du vecteur par les deux enzymes de restriction
-ligation
-transformation
-sélection
-PCR sur colonies
Si tu doutes vraiment de la PCR colonies dans tes conditions/enzymes/clonage, tu peux toujours tester sur quelques minipreps, mais je n'ai jamais eu le cas.Envoyé par Bacillus 100
Tu me conseille donc d'arrêter mon TA cloning et plutôt m'orienter vers du clonage standard (double digestion...)
Toi tu séquence directement aprés PCR même si ton produit correspond à la taille attendus?
Dans le cas ou cela peut être fait, le clonage en double digestion est je trouve plus facile.
Quand je clone, je crible mes clones sur colonies et je ne séquence que 2 ou 3 clones qui sont positifs en PCR. D'ailleurs j'utilise toujours une amorce dans l'insert, l'autre dans le vecteur pour être sûr de la nature de mon vecteur, de mon insert, de la taille de mon insert et de sa position dans le vecteur.
Bon courage
Je suis d'accord avec jmbowie pour la méthodologie.
Et oui, toujours séquencer à chaque étape, ça évite de se retrouver en fin de travail avec un vecteur dont l'insert porterait une mutation !
bon courage !
Que me conseillez-vous comme procédure de purification après PCR et après digestion.
J'ai à ma disposition le kit QIAquick Gel Extraction Kit et celui de Macherey Nagel (NucleoSpin extract II) pour purifier directement après découpe
et pour la purifi après digestion j'ai le kit QIAquick PCR Purification Kit
Qu'en pensez-vous?
J'ai utilisé la kit Qiagen avec succès pour extraire mon produit de PCR du gel d'électrophorèse. En revanche, je ne connais pas les autres kits. Je n'ai pas fait de clonage depuis maintenant deux à 3 ans, mais dans mon souvenir, je ne faisais pas de purification après la digestion, mais la ligation directement. En revanche, tu peux aussi purifier ton insert et ton vecteur après digestion sur un gel d'électrophorèse.
Je pense que les deux kits doivent être bons, les rendements sont peut-être un peu différents !
Bon courage
Salut,
Juste pour vous dire que sa à marché mon clonage est ok.
J'ai procédée ainsi:
Amplification du gène avec des amorces cntenant les sites de restricition
-migration du produit de PCR puis dépôt sur gel et purification
-digestion du produit de PCR et du vecteur+ depôt sur gel+purification
-ligation
-transformation
-PCR sur colonies
-séquençage
Merci et à bientôt
