Préparation des PCR à l'avance?

[invite14bf8030]

Bonjour à tous!!

je viens régulièrement sur ce forum mais cette fois ça n'est pas seulement pour vous lire mais pour poster mon tout premier message car j'ai besoin d'aide!!

Je dois cribler une banque de mutants en utilisant la pcr (un primer dans la region constante de mon tag et le second dans la partie variable et il y a 48 tags différents). Ayant plusieurs milliers de pcr à faire je souhaiterais préparer à l’avance mon mix (taq, dntp, eau, buffer et un primer commun à toutes les réactions) et le dispatcher en plaque 96 puits pour ajouter au dernier moment uniquement l’ADN et le second primer. Y a-t-il des précautions particulières à prendre ?

Que pensez vous des taq master mix commercialisées qui se conservent à temperature ambiante et contiennent la taq, le buffer, les dntp et parfois même le tampon de dépot?

Par ailleurs les solutions de primers (stock à 100 microM) peuvent elle être diluées à 20 microM et conservées à -20° pour être réutilisées directement ?

merci pour votre aide car cela peut me faire gagner beaucoup de temps!!

Hannyael (étudiante semi automatisée!)
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[piwi]

Bonjour.

Je n'ai pas trop l'expérience des mix dont vous parlez. Mais si ils ont été prévu pour cela je ne vois pas raison de ne pas essayer (d'abord sur quelques PCR histoire de voir ce que cela donne).
Il y a longtemps j'avais préparé un mix PCR (dNTP, oligos, taq) en trop. Sachant que je devrais le réutiliser je l'avais congelé et réutilisé le lendemain. Aucun problème. On m'a dit ensuite qu'il ne fallait jamais faire ça et du coup je ne l'ai jamais retenté. Mais si ça à marché pour moi il y a 10 ans, ça devrait marcher avec vous et les taq top moumouttes d'aujourd'hui. Là encore vous pouvez essayer sur un petit volume et vous verrez bien. Si ça tient une nuit ou une semaine ça devrait pouvoir survivre des mois aliquoté.

Pour les oligos, là c'est certain, c'est OK.

Cordialement,
piwi

[invite14bf8030]

Il y a longtemps j'avais préparé un mix PCR (dNTP, oligos, taq) en trop. Sachant que je devrais le réutiliser je l'avais congelé et réutilisé le lendemain. Aucun problème. On m'a dit ensuite qu'il ne fallait jamais faire ça et du coup je ne l'ai jamais retenté.

merci pour votre réponse rapide!!

mais savez vous pour quelle raison on vous a dit qu'il ne fallait jamais faire ça? car si tout le monde prépare ses mix extemporanément il doit y avoir une raison mais je l'ignore...

[piwi]

On m'avait dit que la TAQ était fragile et chère. Je veux bien mais ça avait quand même marché. Alors...
A mon avis, si le mix est préparé et congelé aliquoté et décongelé une seule fois pour utilisation, je ne vois pas où se situe le risque.
Il y a là le poids des traditions qui demeurent sans que personne n'ose les changer, il y a aussi le fait que l'on ne fait pas souvent encore et encore la même PCR mais plusieurs différentes. Dans ce cas de figure congeler des dizaines de mix différents n'est pas très intéressant.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]