Fixation pour immonofluorescence

[invite19c9ae06]

Bonjour à tous,

Je vous explique mon problème...
J'ai transfecté des cellules (culture primaire) avec des plasmides contenant mes gènes d'intérets taggés soit eGFP soit YFP. J'aimerai réaliser des immunomarquages mais j'ai des problèmes avec mes tags. En effet, lorsque je fixe mes cellules, les tags (qui sont solubles) ne sont plus visibles dans mes cellules transfectées avec les plasmides vides. Par contre ils restent visibles dans les cellules transfectées avec les plasmides contenant mes gènes d'intérets. J'ai peur que les méthodes de fixations utilisées n'entrainent une relocalisation cellulaire de mes protéines.

J'ai essayé le PFA 1 et 4%, l'acétone et je suis en train de tester le méthanol.....

Connaissez vous un protocole de fixation permettant de visualiser la GFP et l'YFP et n'induisant pas de relocalisation cellulaire?

Merci beaucoup de votre aide.
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[invite71f23525]

Bonjour,

Je ne pense pas que cela soit un problème de relocalisation cellulaire, sinon tu aurais vu le marquage mais pas à l'endroit attendu. D'autant plus que les méthodes de marquage fixent très rapidement les protéines de la cellule et c'est le but puisqu'elles permettent d'étudier des localisations cellulaires. Certains fluorophores sont incompatibles avec la fixation des cellules. Ils émettent de la fluorescence sur cellules vivantes mais plus sur cellules fixées (exemple : mitotracker, il faut un mitotracker modifié spécifiquement par génie chimique pour qu'il soit compatible avec la fixation des cellules). Je sais que la GFP est compatible avec la fixation des cellules, mais cela dépend peut-être de la protéine à laquelle elle est taggée. D'autre part, ici tu utilises des formes modifiées de la GFP, as-tu regardé dans des publications si de l'observation de fluorescence sur cellule fixées a été réalisé avec ces marqueurs fluorescents?

Greg

[invite19c9ae06]

Merci de ta réponse.
J'ai trouvé dans la littérature la solution... PFA puis methanol. Conservation de la fluorescence GFP/YFP et possibilité de réaliser des immunofluorescences par dessus.

[inviteba148c21]

Salut,

Je vais surement dire quelque chose de tres tres bete, mais je lisais ce que tu avais ecrit, et qq chose a du m'echapper...... Si tu réalise un immunomarquage de tes tag sur vecteur vide c'est normal que tu n'ais pas de marquage nan ? ton tag etant lié a ta sequence codante, sans sequence codante pas de tag... A moins que tu n'ais dans ton vecteur vide inserer ton tag mais pas la sequence de ta proteine d'interet....

Enfin bref, si tu as le temps pour répondre a mon interrogation ca m'éclairerais ma lanterne, sinon tant pis.
Sinon je te confirme que cette méthode de fixation PFA (4%) (15 minutes) puis Méthanol (10minutes) marche vraiment bien.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

Le plasmide vide signifie qu'il n'y a que la GFP. Donc la GFP est exprimée seule, pas en fusion avec la protéine d'intérêt. Cela fournit un contrôle indispensable pour montrer que les conditions utilisées n'affecte pas la localisation de la GFP, et donc prouver qu'une relocalisation éventuelle de la protéine de fusion GFP-X est spécifique de la protéine X.

Greg