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le gel idéal??




  1. #1
    botrytis

    Exclamation le gel idéal??

    Bonsoir les amis

    j'avais précisé dans un post précédent que j'avais effectué une extraction d'ADN qui n'avais rien donné à la 1ère révélation. aujourd'hui je voulais m'en assurer en préparant un autre gel, le problème c'est qu'hier je n'ai obtenue aucune fluorescence contrairement à aujourd'hui . je n'ai donc aucune idée si c'est de l'ADN ou autre chose.

    Est ce que c'est possible de poster la photo du gel et la soumettre à vos yeux d'experts??

    Merci

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    LXR

    Re : le gel idéal??

    Salut,

    Vas-y mets la photo, ce sera plus facile.

    Greg

  4. #3
    botrytis

    Re : le gel idéal??

    Merci LXR, je te préviens, c'est encore nouveau pour moi et chaque étape m'apparait comme un pas de géant.

    Voilà Dr, est ce que c'est grave
    Images attachées Images attachées


  5. #4
    gorben

    Re : le gel idéal??

    Salut,

    La fine bande orange en haut de ton gel c'est ton ADN. Il faudrait que tu laisses plus migrer, ce serait plus joli.
    Vous n'avez pas de camera pour prendre une photo de gel?

    La grosse pattate en bas de ton gel c'est probablement de l'ARN degrade (essais de rajouter un peu de RNase a ta prep pour voir si ca disparait). Il est a la meme taille que le bleu de bromophenol, c'est pour ca que ca fait cette couleur bizarre.

    A+

  6. #5
    botrytis

    Re : le gel idéal??

    Salut,

    tu est sure, c'est de l'ADN en haut??? j'ai déprimé pendant deux jour je croyais que j'avais loupé quelque chose lors de l'extraction.

    Pour la migration je l'ai laissé à 100 volts durant 30 minutes environs (protocole) et pour la camera, je fais avec les moyens du bord

    autres chose, la RNase est à rajouter sur le gel directement

    Merci pour ton diagnostic

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    botrytis

    Re : le gel idéal??

    J'attends toujours la réponse d'LXR !!!

  9. #7
    gorben

    Re : le gel idéal??

    Oui oui je suis sur

    C'est bien de l'ADN genomique? C'est enorme en taille ca ne va quasiment pas migrer sur un gel 0.8%.

    As tu quantifie ton ADN?
    Pour faire la digestion a la RNase, tu prends 9ul d'ADN, tu mix avec 1ul de RNaseA et tu incubes 30 min a 37 deg. ensuite tu mix tes 10ul avec le tampon de charge et tu fais migrer sur ton gel.. Normalement les pattates devraient disparaitres.

    30 min a 100V c'est peu, fait migrer au moins une heure . Il faut que ton front de migration soit a peu pret au 3/4 du gel.

    A+

  10. Publicité
  11. #8
    botrytis

    Re : le gel idéal??

    Merci gorben tu peux pas savoir à quel point ça m'apaise, je vais donc continuer avec le reste de mes échantillons. la quantification est prévue pour cette semaine.

    je suis vraiment contente. en plus tu m'a donné les petites astuces qui font toute la différence. Suivre les protocoles à la lettre c'est bien, mais rien ne vaut un œil avisé. MERCI Merci merci

  12. #9
    gorben

    Re : le gel idéal??

    Je ne sais pas ce que tu veux faire avec ton ADN, mais si tu le quantifies A260 il faut d'abord que tu degrades l'ARN et que tu repurifies l'ADN, sinon ta concentration va etre plus que fausse. Generalement dans les extractions old school il y a une etape de traitement a la RNase avant la precipitation.

    A+

  13. #10
    botrytis

    Re : le gel idéal??

    Re,

    tes questions sont assez pertinentes et je dois dire que j'intègre peu à peu ces nouvelles notions.

    je compte amplifier mes ADN pour une RAPD (étude de la variabilité inter et intra spécifique).

    une de tes remarques m'a interpellée, lorsque dis que l'ADN génomique ne migre pas dans un gel à 0,8%, tu signifie qu'il faut une concentration moindre??

  14. #11
    LXR

    Re : le gel idéal??

    Le pourcentage en agarose d'un gel s'adapte généralement à la taille de ce que tu veux faire migrer. Pour un gel 0,8%, pour un plasmide qui fait 6kb je fais migrer 45 minutes à 100V et mon plasmide n'arrive même pas à la moitié du gel. Dans ton cas, avec de l'ADN génomique c'est au moins de l'ordre de la centaine de kilobases, je ne sais pas de quel organisme tu extrait ton ADN.... Donc ton ADN migre mais très lentement. Dans ce cas soit on passe à un pourcentage en agarose plus faible, soit on augmente le temps de migration. On peut augmenter le voltage mais sur de longues durées ça chauffe trop, ça peut causer des changements de migration.

    Je n'ai jamais fait migrer d'ADN génomique mais si je devais le faire, pour une centaine de kilobases je prendrais un gel 0,2% d'agarose plutôt...Après tout dépend de ce que tu veux voir.

    Greg

    PS : Si tu avais posé ces questions dans la discussion que tu avais déjà créé pour l'occasion (révélation extraits ADN) ça aurait été mieux puisque les deux discussions traite la même expérience. Ainsi les réponses aurait eu plus de chance d'être complètes et pertinentes. Tu le sauras pour la prochaine fois.
    Dernière modification par LXR ; 22/05/2009 à 00h37. Motif: Petite remarque

  15. #12
    gorben

    Re : le gel idéal??

    Citation Envoyé par LXR Voir le message
    Je n'ai jamais fait migrer d'ADN génomique mais si je devais le faire, pour une centaine de kilobases je prendrais un gel 0,2% d'agarose plutôt...Après tout dépend de ce que tu veux voir.
    Non non surtout pas d'agarose 0.2%. En theorie ce serait mieux, mais un gel en dessous de 0.5% est clairement pas manipulable. La seule maniere de bien faire migrer de l'ADNg c'est une PFGE mais ca ne sert absolument a rien dans la manip.
    Generalement l'ADNg est fragmente durant la purif en fragment d'environ 50 a 150kb. Il migre donc tres haut.

    a+

  16. #13
    botrytis

    Re : le gel idéal??

    bonjour,

    je crois que je vais faire migrer plus longtemps (apparemment 30 minutes c'est insuffisant) ou peut etre préparer un gel à 0.6% je vous tiendrez au courant dans quelques heures


    PS: Je sais que mes deux questions se sont chevauchées, ça c'est fait dans la précipitation. ta remarque est retenue

  17. #14
    LXR

    Re : le gel idéal??

    Le plus bas que j'ai fait c'est 0.4% d'agarose et ça pouvait encore allé, d'où ma remarque sur le 0.2%....C'est vrai que ça fait peu. Déjà si tu fais un 0.6% ce sera mieux en effet. Mais ton but n'est apparemment pas de séparer des fragments d'ADN génomique, c'est plutôt pour voir si ta purif a bien marché, je me trompe? Dans ce cas l'important est que ton ADN génomique rentre dans le gel pour vérifier la netteté de la bande, afin de voir s'il n'y a pas de dégradation qui causerait un smear en-dessous. Tu peux laisser 40-50 minutes sans problème, ça ne sortira pas du gel.

    Greg

  18. #15
    botrytis

    Re : le gel idéal??

    Exact LXR tu as bien deviné, mon véritable soucis c'était plutôt de tester la justesse de mon protocole,surtout que je ne voulais pas travailler avec le kit. j'aime bien maitriser toutes les étapes pour comprendre le déroulement des choses. j'ai donc opté pour le 0,6%.

    En tout cas, merci à toi et à Gorben de m'avoir si bien orientée

  19. #16
    LXR

    Re : le gel idéal??

    Citation Envoyé par botrytis Voir le message
    j'aime bien maitriser toutes les étapes pour comprendre le déroulement des choses.
    C'est une excellente démarche, au moins s'il y a un problème lors d'une des étapes tu seras immédiatement fixé

    Greg

  20. #17
    piwi

    Re : le gel idéal??

    C'est inutile de diminuer encore la concentration en agarose dans le gel. Les fragments d'ADN génomique sont simplement trop gros pour être résolus dans un gel d'agarose en électrophorèse classique. Mais ce n'est pas ce que vous souhaitez faire, donc pas de souci à avoir. Ce que vous vouliez était évaluer la qualité de votre extraction. Si vous souhaitez éliminer toute trace d'ARN ajoutez de la RNase et allongez un peu l'étape.

    Sinon, ajoutez un marqueur de poids moléculaire à votre gel et nettoyez un peu la vitre de votre lampe à UV.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  21. #18
    Petrucci

    Re : le gel idéal??

    En fait tu as réalisé quoi comme extraction ? Tu es parti de quoi ? que tu as extrait comment ?

    Parce que effectivement la bande du haut s'avèrerait être de l'ADN. D'autant que les ADN c'est très gros et ça ne migrent pas bien loin. Après tu veux en faire quoi de ton ADN ? Une PCR de vérification serait peut-être pas mal ?

    Sinon en ce qui concerne la bande que tu vois en bas, je ne pense vraiment pas que ce soit de l'ARN pour plusieurs raisons. Pour visualiser des ARN, il faut faire un gel RNAse free, si tu fais un gel classique, il y a de grandes chances qu'ils soient dégradés. Ensuite, pour visualiser des ARN, il faut en mettre une quantité relativement importante et troisièmement, si tu voyais des ARN en bas, tu en verais aussi en haut qui représenteraient les ARN 18s par exemple. Or ici on ne voit qu'une faible bande en haut et un petit paté en bas qui selon moi n'est rien autre que des ADN un peu degradé, d'ailleurs, on peut voir un léger smear sur ton gel.

    Mon conseil, fait un gel 0,8 % agarose, grands puits, mets 10 uL d'ADN et laisse bien migrer. Révèlé au BET et si il y a bande aux UV, cela veut dire qu'il y a ADN (ou ARN même si bon...j'ai déjà expliqué.). Si tu ne vois rien, il n'y a pas d'ADN, si il y a un smear, il y a des ADN mais tout dégradés.

    Voilà.

    Cordialement.

  22. #19
    Yoyo

    Re : le gel idéal??

    Salut

    Si lors de l'extraction il n'y a pas eut de RNAse utilisé alors la smear d'en bas est bien de l'ARN. On ne vois pas les ARNr car justement ils sont dégradés!

    YOyo

  23. #20
    gorben

    Re : le gel idéal??

    Salut,

    Oui oui, la patate en bas c'est clairement de l'ARN

    A+

  24. #21
    Petrucci

    Re : le gel idéal??

    Ok, autant pour moi.

    Il en est où ton gel alors ?

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