extraction d'ADN plasmidique

[invite75f3c15f]

Bonsoir,
j'aurais une question a poser à ceux qui qui métrisent un peu les protocoles d'extraction d'ADN plasmidique.c'est la première fois que je manipule et et les bactéries sur lesquelles je travaille sont des lactobacilles et des lactocoques.

1- j'ai trouvé dans la littérature qu'il faut:
- incuber ces bactéries en présence d'une solution de sacharose 25% contenant du lysosyme à une concentration finale de 30mg/ml pendant 01 heure, et cela afin de fragiliser la paroi bactérienne.
- ensuite, les incuber dans un tampon de lyse (NaOH 0,2 + sds 3%) pendant 15 minutes.

est-que cela est vraiment suffisant pour avoir une bonne lyse des cellules ou il y'a d'autres solutions ou tampons qui permettent d'avoir de meilleurs résultats de lyse.

autre question: j'ai aussi trouvé que le phenol à utiliser doit etre saturé. comment doit-on le saturer et avec quelle solutions. et est-que cette saturation permet l'obtention d'un ADN plus pur que celui obtenu en utilisant du phenol non saturé

PS: c'est ma première extraction d'ADN, je n'ai jamais eu à le faire auparavant, alors un peut d'indulgence. Merci
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[invite4bded444]

Bonsoir,
j'aurais une question a poser à ceux qui qui métrisent un peu les protocoles d'extraction d'ADN plasmidique.c'est la première fois que je manipule et et les bactéries sur lesquelles je travaille sont des lactobacilles et des lactocoques.

1- j'ai trouvé dans la littérature qu'il faut:
- incuber ces bactéries en présence d'une solution de sacharose 25% contenant du lysosyme à une concentration finale de 30mg/ml pendant 01 heure, et cela afin de fragiliser la paroi bactérienne.
- ensuite, les incuber dans un tampon de lyse (NaOH 0,2 + sds 3%) pendant 15 minutes.

est-que cela est vraiment suffisant pour avoir une bonne lyse des cellules ou il y'a d'autres solutions ou tampons qui permettent d'avoir de meilleurs résultats de lyse.

autre question: j'ai aussi trouvé que le phenol à utiliser doit etre saturé. comment doit-on le saturer et avec quelle solutions. et est-que cette saturation permet l'obtention d'un ADN plus pur que celui obtenu en utilisant du phenol non saturé

PS: c'est ma première extraction d'ADN, je n'ai jamais eu à le faire auparavant, alors un peut d'indulgence. Merci

En ce qui concerne le protocole, je regarde ça et je te le dis, je n'ai pas le détails des concentrations du protocole en tête.

Pour le phenol, il se trouve qu'avant il fallait le saturé soit même et maintenant il s'achète tout fait, enfin saturé quoi. Pour l'extraction d'ADN on utilise du phénol saturé avec du tris et pour l'extraction d'ARN avec de l'eau. A ce que l'on m'a dit, les ARN reste dans la phase aqueuse et les protéines resteraient dégradées à l'interphase.

[invite4bded444]

Je précise :

Bonsoir,
j'aurais une question a poser à ceux qui qui métrisent un peu les protocoles d'extraction d'ADN plasmidique.c'est la première fois que je manipule et et les bactéries sur lesquelles je travaille sont des lactobacilles et des lactocoques.

1- j'ai trouvé dans la littérature qu'il faut:
- incuber ces bactéries en présence d'une solution de sacharose 25% contenant du lysosyme à une concentration finale de 30mg/ml pendant 01 heure, et cela afin de fragiliser la paroi bactérienne.
- ensuite, les incuber dans un tampon de lyse (NaOH 0,2 + sds 3%) pendant 15 minutes.

est-que cela est vraiment suffisant pour avoir une bonne lyse des cellules ou il y'a d'autres solutions ou tampons qui permettent d'avoir de meilleurs résultats de lyse.

autre question: j'ai aussi trouvé que le phenol à utiliser doit etre saturé. comment doit-on le saturer et avec quelle solutions. et est-que cette saturation permet l'obtention d'un ADN plus pur que celui obtenu en utilisant du phenol non saturé

PS: c'est ma première extraction d'ADN, je n'ai jamais eu à le faire auparavant, alors un peut d'indulgence. Merci

Voici mon protocole:

l’extraction est réalisée selon la méthode de lyse alcaline décrite par Birnboim (1983). Les bactéries sont cultivées dans 2 ml de milieu liquide 2YT pendant une nuit à 37°C sous agitation. L’extraction est réalisée à partir de 1.5 ml de culture à saturation. Le culot cellulaire, obtenu par centrifugation à 10000 g pendant 1 minutes, est repris dans 100 µl de tampon (glucose 50 mM ; EDTA 10 mM ; Tris-HCl 25 mM pH 8,0). Les cellules sont lysées par l’action de 200 µl d’une solution NaOH 0,2 N / SDS 1% pendant 5 minutes dans la glace. L’ADN chromosomique et les protéines dénaturées sont précipités par 150 µl d’une solution d’acétate de potassium 3 M pendant 5 minutes à 4°C puis éliminés par centrifugation (1000 g pendant 5 minutes à 4°C).

Un volume d’éthanol 100% froid est ajouté au surnageant afin de précipiter l’ADN plasmidique pendant 5 minutes à température ambiante. Après 5 minutes de centrifugation à 10000 g, le surnageant est éliminé et le culot est lavé dans une solution Tris 0,1 M / éthanol 70% puis dans l’éthanol 100%. Le culot est séché puis repris dans 30 µl de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 ; EDTA 0,1 mM pH 8,0) contenant de la RNase (0,2mg/ml).


Pas de phénol.

Voilà.

[invite71f23525]

Lorsque tu postes deux messages en suivant, ce n'est pas la peine de citer à nouveau le message précédent, à moins qu'il y ait un passage que tu veuilles mettre en évidence. Cela évite d'avoir des discussions très longues avec finalement peu de contenu.

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

- ensuite, les incuber dans un tampon de lyse (NaOH 0,2 + sds 3%) pendant 15 minutes.

SDS 3% me semble un peu beaucoup. De mémoire ça ne doit pas excéder 1%. 15 minutes, c'est long. 5 minutes suffisent. Quant à la question de fond qui est de savoir si la lyse est optimale, la réponse est oui à condition d'avoir bien resuspendu vos bactéries dans la solution glucose-EDTA-RNase (n'oubliez pas la RNase, sinon vous allez vous ramasser des ARNs qui vont vous embêtez).

Pour le phénol, c'est le phénol que vous achetez pour faire du phénol-chloroforme 50/50 tout bête.

Cordialement,
piwi

[invite4bded444]

Lorsque tu postes deux messages en suivant, ce n'est pas la peine de citer à nouveau le message précédent, à moins qu'il y ait un passage que tu veuilles mettre en évidence. Cela évite d'avoir des discussions très longues avec finalement peu de contenu.

Greg

Oups désolé.