Récupération du contenu protéique

[invitef9400402]

Bonjour,

Quand je récupère le contenu protéique d'une culture cellulaire avec du Tampon RIPA + Inhibiteurs de protéases et Phosphatases, après la dernière phase, cad, la centrifugation de 10 min à 14 000 Rpm, lorsque je dois récupérer le surnageant pour le congeler, je n'y arrive pas, car il y a une partie visqueuse qui vient avec, et en plus, je ne vois pas de culot...
Je voudrais savoir, à quoi correspond cette partie visqueuse??? et pourquoi je ne vois pas clairement un culot qui correspond à mes débris cellulaires?

Merci d'avance pour votre aide!
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[Yoyo]

salut

je dirais que ce sont les acides nucléiques.

Yoyo

[piwi]

Vous pouvez (et vous devez) soniquer un bon gros coup jusqu'à ce que la solution soit fluide.

Cordialement,
piwi

[invitef9400402]

Merci pour votre aide...mais je n'ai pas de sonicateur!

[A voir en vidéo sur Futura]

[Zellus]

Salut,

Ca doit en effet être dû à l'ADN. Si tu n'as pas de sonicateur, tu peux utiliser de la DNase.

[invitef9400402]

Merci pour l'idée de la DNAse!
Par contre une autre question et j'espère que ce sera la dernière, comment puis-je utiliser la DNAse? mes protéines sont dans du tampon RIPA...je suppose que la DNAse doit être dans un tampon approprié pour agir...

[Zellus]

Salut,

Généralement on utilise de la DNaseI à des concentrations comprises entre 0,1 et 1 mg/mL. Il faut lui rajouter 1 mM de MgCl₂ voire 2 ou 3 mM si il y a de l'EDTA ou de l'EGTA par exemple.
Je pense qu'il n'y aura pas de problème du tout avec ton tampon.

[invitef9400402]

Il ya a qlqchose qui m'échappe totalement:
Je rajoute 1mM de MgCl₂ dans mon lysat protéique c'est à dire que je rajoute une solution très concentrée de MgCl₂ pour ne pas changer mon volume de lysat. Est ce que c'est ça?
Puis j'ajoute de la DNAse à la concentration que tu m'as indiquée...

[Zellus]

Oui c'est bien ça. Tu rajoutes du MgCl₂ concentré pour être à 1 mM final et après tu rajoutes ta DNase concentrée pour être aux alentours de 0,5 mg/mL par exemple. Certaines personnes chauffent un peu d'après ce que j'ai pu voir mais perso je ne l'ai jamais fait. Il faut juste que tu regardes si la texture de ton lysat devient moins visqueuse. Si tu touilles avec une spatule ou une pipette tu sentiras bien la différence.

[inviteb94d8e21]

Une vieille technique consiste à fragmenter l'ADN en faisant aspirant-refoulant (6-10 fois) la solution dans une seringue avec une aiguille 23G (Terumo bleue).

[invitef9400402]

Avec tout ça, je devrais m'en sortir!

Merci énormément pour votre aide!