Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 5 sur 5

Transfection Calcium Phosphate



  1. #1
    Natibus

    Unhappy Transfection Calcium Phosphate

    Bonjour,

    Je suis à la recherche d'un protocole pour transfecter des P19Cl6 (Cellules murines) par la technique du Calcium Phosphate...

    Cela fait trois semaines que je le fais avec le protocole donné par mon supérieur mais rien à faire: efficacité de transfection à 10-15%. J'ai testé avec la lipofectamine 2000 et ça fonctionne du tonnerre (70%)... Mais malheuresement, mon boss ne jure que par le calcium phosphate et veux que je persiste!!

    Aidez moi s'il vous plait, je commence à désespérer...
    Bonne journée à Tous!

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    LXR

    Re : Transfection Calcium Phosphate

    Bonjour,

    Sur cette page, tu as 6 protocoles de transfection avec cette méthode. Sinon tu as aussi la possibilité de transfecter avec un polymère cationique comme le polyethyleneimine (PEI). Personnellement je transfecte avec cette méthode et ça marche très bien. Le mieux est que le PEI que j'utilise n'est pas sous forme de kit, c'est une fiole avec 100 ml de PEI, de quoi faire des transfections pendant plus de 50 ans et je n'exagère pas. Si cela t'intéresse, tu peux trouver ce produit chez des fournisseurs de produits chimiques comme sigma.

    Greg

  4. #3
    Natibus

    Re : Transfection Calcium Phosphate

    Bonjour,

    Merci beaucoup Greg.

    50 ans... Waouh cela m'aurait bien intéressé, mais le problème c'est que je ne suis que technicien de recherche, mais mon supérieur me prend pour un thésard, enfin bref, tout cela pour dire qu'il ne sera sûrement pas intéressé! Même après plusieurs essais TRES TRES concluant avec la Lipofectamine2000, il clame toujours haut et fort que le CaPo est la meilleure technique de transfection!!

    Merci encore,

    Bon dimanche

  5. #4
    zorro45

    Re : Transfection Calcium Phosphate

    Bonjour,

    Effectivement, je crois que certaines lignées résistent à la transfection par CaP: ça m'est arrivé.
    Voici ma recette, une de plus.
    Ce que j'ai lu chez Maniatis, c'est qu'il faut faire très attention aux solutions de Ca Cl2 et de HEPES. Le pH est très important. On garde les solutions à -20°C et on les teste; on ne garde que celles qui permettent la transfection.
    Peut-être pour vérifier que les problèmes viennent des cellules et pas de la méthode, tentez de transfecter une autre lignée comme les CV1, MCF7, etc pour lesquelles ça marche.
    Bon courage.




    Transfection, méthode précipitation DNA au phosphate de calcium


    1) cellules
    La veille, préparer cellules telles que 80% confluence le jour de la transfection
    1.5 –3 106 cellules B16 par boîte de Petri 10 cm

    Cellules dans Petri, 10 ml milieu neuf ajouté 3 heures avant la transfection

    2) DNA
    DNA qualité extra
    DNA en solution dans Tris 5 mM, pH8, ou TE

    par boîte de Petri, 10cm : 15 microgrammes DNA

    Compter 1 ml solution de solution de transfection par boîte

    pour 1 boîte :

    x microlitres DNA
    62 microlitrel 2 M CaCl2
    H20 qsp 0.5 ml


    pour contrôle : x microlitre tampon 5 mM Tris
    reste : idem

    Solutions à temp ambiante
    Verser goutte à goutte dans 0.5 ml 2XHBS, sous agitation douce au vortex
    Laisser précipiter sur la paillasse, 30 minutes : solution trouble


    3) Transfection
    Agiter la solution d’ADN au vortex
    Sous la hotte :
    Verser sur les cellules 1 ml solution DNA, goutte à goutte, en agitant doucement
    Incuber dans l’étuve à 37°C. Temps à déterminer : dépend des cellules (une nuit pour B16)

    Le lendemain : vérifier la présence du précipité au microscope (voit des petites choses noires, comme des aiguilles de sapin).
    Retirer le milieu et ajouter du milieu frais

    Laisse ensuite 48 (72) heures avant début de sélection ou analyse expression transitoire



    2XHBS :
    50 mM HEPES, pH7.1
    280 mM NaCl
    1.5 mM Na2HPO4
    pH7.1

    Conserver à -20°C CaCl2 2M « bonne solution » 2XHBS en aliquot

    Cf Maniatis, Promega,
    HBS
    1- solution Na2 HPO4 M = 177.99
    150 mM 1.33g / 50 ml

    2- pour 100 ml HBS
    1 ml Na2 HPO4 150 mM
    1.6 g NaCl
    1 g HEPES

    NaOH 0.5 M jusqu’à pH = 7.05
    Donc sans sucrose ni KCl

    3- filtrer sur 0.2 micromètre

    CaCl2
    CaCl2, 2 H2O 2M M = 147
    7.35 g/25 ml
    filtrer sur 0.2 micromètre


    Solutions conservées à -20°C

  6. #5
    zorro45

    Re : Transfection Calcium Phosphate

    Bonjour Greg,

    Je suis très intéressé par la transfection par PEI, mais je n'ai pas beaucoup de temps pour faire de la mise au point. J'ai ai vu plusieurs versions. Si la votre est fool-proof, je suis preneur...Merci.

  7. A voir en vidéo sur Futura

Discussions similaires

  1. [Master (M1-M2)] Transfection
    Par bassoumitto dans le forum Exercices en biologie
    Réponses: 1
    Dernier message: 02/01/2009, 08h11
  2. Phosphate de Calcium et solubilité
    Par FFabman dans le forum Chimie
    Réponses: 1
    Dernier message: 13/12/2008, 21h54
  3. Réponses: 0
    Dernier message: 09/06/2008, 12h11
  4. [Génétique] transfection
    Par val62 dans le forum Biologie
    Réponses: 3
    Dernier message: 29/11/2007, 21h07
  5. [Génétique] Transfection
    Par génétique 2005 dans le forum Biologie
    Réponses: 3
    Dernier message: 02/09/2007, 12h20