Transfection Calcium Phosphate

[invite150c05de]

Bonjour,

Je suis à la recherche d'un protocole pour transfecter des P19Cl6 (Cellules murines) par la technique du Calcium Phosphate...

Cela fait trois semaines que je le fais avec le protocole donné par mon supérieur mais rien à faire: efficacité de transfection à 10-15%. J'ai testé avec la lipofectamine 2000 et ça fonctionne du tonnerre (70%)... Mais malheuresement, mon boss ne jure que par le calcium phosphate et veux que je persiste!!

Aidez moi s'il vous plait, je commence à désespérer...
Bonne journée à Tous!
-----

[invite71f23525]

Bonjour,

Sur cette page, tu as 6 protocoles de transfection avec cette méthode. Sinon tu as aussi la possibilité de transfecter avec un polymère cationique comme le polyethyleneimine (PEI). Personnellement je transfecte avec cette méthode et ça marche très bien. Le mieux est que le PEI que j'utilise n'est pas sous forme de kit, c'est une fiole avec 100 ml de PEI, de quoi faire des transfections pendant plus de 50 ans et je n'exagère pas. Si cela t'intéresse, tu peux trouver ce produit chez des fournisseurs de produits chimiques comme sigma.

Greg

[invite150c05de]

Bonjour,

Merci beaucoup Greg.

50 ans... Waouh cela m'aurait bien intéressé, mais le problème c'est que je ne suis que technicien de recherche, mais mon supérieur me prend pour un thésard, enfin bref, tout cela pour dire qu'il ne sera sûrement pas intéressé! Même après plusieurs essais TRES TRES concluant avec la Lipofectamine2000, il clame toujours haut et fort que le CaPo est la meilleure technique de transfection!!

Merci encore,

Bon dimanche

[invitefcc920d3]

Bonjour,

Effectivement, je crois que certaines lignées résistent à la transfection par CaP: ça m'est arrivé.
Voici ma recette, une de plus.
Ce que j'ai lu chez Maniatis, c'est qu'il faut faire très attention aux solutions de Ca Cl2 et de HEPES. Le pH est très important. On garde les solutions à -20°C et on les teste; on ne garde que celles qui permettent la transfection.
Peut-être pour vérifier que les problèmes viennent des cellules et pas de la méthode, tentez de transfecter une autre lignée comme les CV1, MCF7, etc pour lesquelles ça marche.
Bon courage.




Transfection, méthode précipitation DNA au phosphate de calcium


1) cellules
La veille, préparer cellules telles que 80% confluence le jour de la transfection
1.5 –3 106 cellules B16 par boîte de Petri 10 cm

Cellules dans Petri, 10 ml milieu neuf ajouté 3 heures avant la transfection

2) DNA
DNA qualité extra
DNA en solution dans Tris 5 mM, pH8, ou TE

par boîte de Petri, 10cm : 15 microgrammes DNA

Compter 1 ml solution de solution de transfection par boîte

pour 1 boîte :

x microlitres DNA
62 microlitrel 2 M CaCl2
H20 qsp 0.5 ml


pour contrôle : x microlitre tampon 5 mM Tris
reste : idem

Solutions à temp ambiante
Verser goutte à goutte dans 0.5 ml 2XHBS, sous agitation douce au vortex
Laisser précipiter sur la paillasse, 30 minutes : solution trouble


3) Transfection
Agiter la solution d’ADN au vortex
Sous la hotte :
Verser sur les cellules 1 ml solution DNA, goutte à goutte, en agitant doucement
Incuber dans l’étuve à 37°C. Temps à déterminer : dépend des cellules (une nuit pour B16)

Le lendemain : vérifier la présence du précipité au microscope (voit des petites choses noires, comme des aiguilles de sapin).
Retirer le milieu et ajouter du milieu frais

Laisse ensuite 48 (72) heures avant début de sélection ou analyse expression transitoire



2XHBS :
50 mM HEPES, pH7.1
280 mM NaCl
1.5 mM Na2HPO4
pH7.1

Conserver à -20°C CaCl2 2M « bonne solution » 2XHBS en aliquot

Cf Maniatis, Promega,
HBS
1- solution Na2 HPO4 M = 177.99
150 mM 1.33g / 50 ml

2- pour 100 ml HBS
1 ml Na2 HPO4 150 mM
1.6 g NaCl
1 g HEPES

NaOH 0.5 M jusqu’à pH = 7.05
Donc sans sucrose ni KCl

3- filtrer sur 0.2 micromètre

CaCl2
CaCl2, 2 H2O 2M M = 147
7.35 g/25 ml
filtrer sur 0.2 micromètre


Solutions conservées à -20°C

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitefcc920d3]

Bonjour Greg,

Je suis très intéressé par la transfection par PEI, mais je n'ai pas beaucoup de temps pour faire de la mise au point. J'ai ai vu plusieurs versions. Si la votre est fool-proof, je suis preneur...Merci.