Bonjour,
Je voudrais savoir comment est-ce que vous faites pour isoler les mitochondries des autres organelles d'une cellule (j'utilise des CHO, mais je ne pense pas que ca soit très différent des autres).
J'ai trouvé des protocoles, mais malheureusement ma centrifugeuse n'est pas une ultra-centrifugeuse et ne montre pas jusqu'a 7'000xg.
Merci d'avance de votre réponse
Salut
Pour purifier les mitochondries, il faut obligatoirement une ultracentrifugeuse.
Pour la pureté, on passe par un gradient de Percoll ou par un gradient de sucrose, et cela se fait en ultra.
Pour les premiers culotages différentiels t'en a pas besoin, mais si tu veux des mitos propres y a pas d'autres solutions que l'ultra.
Si tu n'en a pas, je suis sur que des labos à côté en ont, demande leur
Bon courage
Je suis dans une entreprise... et je travaille dans le seul labo de recherche... les autres sont du contrôle... Donc non malheureusement ya pas d'ultra-centri.
Mon but n'est pas spécialement de purifier les mitochondries, mais de pouvoir les différencier des autres organelles, car j'ai marqué une protéine qui devrait aller dans la mitochondrie avec du RFD et au microscope c'est pas claire si c'est une mito ou pas. Donc en les isolants, ca me permetterai de voir plus claire...
Dans ce cas là, t'as pas besoin de purifier tes mitochondries. Ce qu'il te faut c'est un marqueur spécifique de la mitochondrie. Comme ça tu peux voir si il y a colocalisation entre le marquage de ta protéine et le marquage de tes mitochondries. Tu peux utiliser le Mitotracker (Invitrogen je crois) comme marqueur.
Le Mitotracker nécessite une optimisation de sa concentration car il a tendance à marquer aussi d'autres structures cellulaires, donc un risque de fausse interprétation. Un marqueur de la mitochondrie beaucoup plus spécifique et permettant une localisation des mitochondries plus résolue est un marquage anti-Hsp60. Mais encore faut-il que tu puisses faire de la microscopie à fluorescence dans ton laboratoire.
Greg
Nous avons un microscope a fluorescence (heureusement sinon je serai embêtée avec ma protéine marquée RFP).
Greg, ou est-ce que je pourrais trouver le marqueur anti-Hsp60 ? car j'ai regardé et je ne l'ai pas trouvé. Est-ce qu'il est déjà fluorescent ? si oui de quelle couleur ? Car ce serait embêtant si c'était également rouge.
Merci de ta réponse !
Le marquage anti-Hsp60 se fait par immunofluorescence. Dans mon protocole, j'utilises un anticorps monoclonal anti-Hsp60 (Santa Cruz Biotechnology). Le protocole non détaillé :
- Lavage au PBSdes cellules ensemencées sur lamelle au fond d'une plaque 6 puits.
- Fixation paraformaldehyde 3,7% dans PBS, 15 minutes
- Perméabilisation avec saponine 0,05% dans PBS 10-15 minutes
- Saturation dans PBS + 3% BSA + 0,05% saponine pendant 20 minutes
- Incubation anticorps anti-Hsp60 au 1/100ème dans PBS 0,05% saponine 1% BSA, 1h
- Lavage 2 fois avec PBS 0,05% saponine 1% BSA
- Incubation anticorps secondaire Alexa 488 nm goat anti-mouse 1/800ème dans PBS 0,05% saponine 1% BSA, 1h
- Lavage 2 fois avec PBS
Ensuite, si tu veux marquer les noyaux, tu adapteras la suite du protocole : DAPI dans PBS pendant 5 minutes, DAPI dans mowiol (liquide de montage), FluorSafe + DAPI.
Si tu ne veux pas les marquer :
- Montage des lamelles sur lame avec liquide de montage (Mowiol, FluorSafe, Dako Cytomation,....)
L'Alexa 488 nm émet dans le vert donc pas de souci de ce côté là, tu mets le cube FITC sur ton microscope et c'est bon.
Greg
Tu as déjà essayé un protocole de centrifugation différentielle ?
Tu peux séparer les organites cellulaires en plusieurs étapes (mais il faut centrifuger à grande vitesse : 15000 g)
Elodie
Merci Greg pour le détail du protocole ! Dès que mes petites cellules auront décidées de se laisser transfecter je le testerai... J'ai hate de voir si ca a fonctionné.
Elodie : Non je n'ai pas la centrifugation différentielle, en faite je n'ai encore rien essayé car je n'ai pas encore recu de bon resultat de ma transfection. Mais je suis prête a essayer plusieurs solutions pour trouver la quelle convient le mieux aux différentes recherches que je fais. Pour la centrifugation différentielle, je suis partante, surtout que notre centri monte jusque la (pas plus malheureusement). Est- ce qu'il te serai possible de me transmettre un protocole ?
Merci d'avance !
Gaelle
Tu peux trouver plusieurs protocoles de centrifugation différentielle sur le net, moi j'en ai un mais il est dans un bouquin!
Voici un lien qui pourrait t'aider :
http://www.scifa.univ-metz.fr/cours/...ture-seule.pdf
Dans mon protocole, pour l'étape 2 (après s'être débarassé du premier culot contenant les débris cellulaires et noyaux), ils centrifugent à 15000g pdt 5min. Tu récupères ainsi les mitochondries, les peroxysomes et les lysosomes. Ensuite, à toi de jouer pour isoler les mitochondries en utilisant par exemple un marquage immunofluorescent.
J'espère avoir pu t'aider !
@+
Merci de toutes vos réponses ! Je vais faire des essais avec les différentes méthodes voir laquelle correspond le mieux à ce que je recherche ! Merci encore d'avoir pris le temps de me répondre.
@+
Gaelle
