Extraction d'enzymes musculaires

[invite1c60740f]

Bonjour à tous !

Voilà, je suis biologiste et assistante à temps plein à l'université. Je travaille sur une thèse concernant la physiologie musculaire.
J'aimerais solliciter votre aide car j'essaye de mettre au point un protocole de dosage enzymatique. Pour celà, j'ai besoin d'extraire l'enzyme d'intérêt de muscles de souris.
Ma question est la suivante: J'effectue un dosage protéique de mon extrait musculaire (après l'avoir broyé dans du tampon), un dosage Bradford. Est-ce que quelqu'un connait la quantité de protéines qu'on peut "récupérer' en broyant un morceau de muscle de 100 mg par exemple ? Moi j'obtiens une très faible quantité (enfin, je pense) => environ 2µg/µl. Est-ce possible ? Est-ce insuffisant ? Est-ce que quelqu'un pourrait m'aider ?

Merci d'avance pour votre réponse,
@ +
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[LXR]

Bonjour,

Au niveau de la quantité de protéine extraite, pourquoi veux-tu une concentration de protéines supérieure à 2 µg/µl sans avoir (enfin je pense vu la tournure du message) mesurer l'activité enzymatique voulue? Personnellement je trouve cette concentration satisfaisante. Pour avoir une concentration plus importante il suffit d'ajuster le volume de tampon de lyse, ou lyser plus de matériel biologique tout simplement.

Pour qu'une personne puisse te répondre sur la quantité moyenne de protéines extraites à partir de 100 mg de muscle de souris, il faudrait préciser quel tampon de lyse tu utilises et quelles conditions physiques tu appliques (vortex, sonication, choc thermique,...), ainsi que la catégorie de souris utilisée (balb/c, C57BL6, nude,...).

Le mieux reste que tu testes ton activité enzymatique dans les extraits que tu as. S'il n'y a rien de détectable avec 2 µg/µl de protéines, c'est à partir de là qu'il faudra penser à mettre au point la manip.

Greg

[invite1c60740f]

Merci pour ta réponse Greg.
C'est vrai qu je n'ai pas été tout à fait claire dans ma question, en fait, j'ai justement testé mon activité enzymatique sur ce que j'ai extrait et je n'obtiens rien...
En fait, je désire doser la malate déshydrogénase, une enzyme assez classique du cycle de Krebs. Pour celà, j'excise des muscles de la patte (souris NMRI contrôles), qui sont ensuite congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80°c. Pour ma manip de dosage, j'ai testé plusieurs techniques de broyage: mortier et pillon + azote liquide afin de réduire le muscle en poudre ensuite réhydratation dans du tampon PBS EDTA; Potter + tampon de lyse commercial (pour détruire les membranes cellulaires) sur glace afin de ne pas dégrader mes protéines.
L'autre partie du test correspond à la détection de l'activité enzymatique en reproduisant les conditions de la réaction: ajout de substrat (oxaloacétate), cofacteur (ici NADH) et tampon réactionnel (Triethanolamine HCl) + extrait musculaire qui est SENSE contenir l'enzyme d'intérêt...
Le tout est réalisable grâce à la lecture de la densité optique à 340 nm (longueur d'onde d'absorbance du NADH) d'un spectrophotomètre. Lors de la réaction, le NADH se transforme en NAD+ (par oxydation) et donc, il disparait peu à peu (pour autant que la réaction ait lieu). Par conséquent, la densité optique DIMINUE au cours du temps.

OUF, ça va? on me suit toujours là ?

Mon problème est que je ne constate aucune décroissance (j'ai effectué des dilutions de mon extrait musculaire,...) ou alors une très faible après 1 ou 2 secondes (pas significative car identique même en diluant 10 fois l'extrait musculaire) ensuite, plus rien ne diminue, tout est stable...

Alors je cherche à savoir où ma manip foire ? lors du broyage ou ailleurs dans le test ? J'ai aussi testé sur du foie (lieu riche en enzymes) et malgré tout rien.

J'espère que tu pourras m'éclairer dans ma démarche car j'ai l'impression de ne plus avoir d'idées.

Merciiii

[LXR]

Dans ta manip enzymatique, étant donné que l'enzyme est bien connue, as-tu mis un témoin positif de la réaction enzymatique = ton milieu réactionnel avec la malate déshydrogenase recombinante? Car tes extraits sont peut-être excellents mais les conditions réactionnelles mauvaises (provenant des réactifs ou du protocole).

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite1c60740f]

Non, malheureusement, cette enzyme purifiée commerciale coute relativement cher et mon chef de service n'a pas décidé d'en commander...
En ce qui concerne les réactifs du protocole, ce sont de nouveaux produits. De plus, le protocole que je réalise est une adaptation de protocoles déjà existants dans la littérature scientifique (on y développe pas vraiment le mode opératoire mais en ce qui concerne les concentrations de chaque réactifs, tout est décrit).

La semaine prochaine, je vais tester un protocole bien expliqué et réalisé sur la meme enzyme mais provenant de végétaux (mais, pomme de terre..) j'espère obtenir des résultats car c'est une manip proposée pour des travaux pratiques d'étudiants.

Si tu as d'autres idées, elles sont le bienvenues ! merci !

[LXR]

Cela coûte peut-être cher mais il n'y a pas meilleur moyen pour contrôler que le protocole et les réactifs sont bons pour mesurer cette activité enzymatique. Tâtonner et refaire plusieurs fois un protocole qui ne marche pas peu faire perdre au labo plus d'argent que ce qu'il en aurait été si tous les bons tests avaient été faits au début. Mais cela ne regardes que le responsable de service a priori.

Suis-tu un protocole d'extraction adapté à la mesure de cette activité enzymatique?

Greg

[invite1c60740f]

Je suis entièrement d'accord avec toi mais j'ai déjà lancé l'idée d'en commander mais il ne m'a toujours rien dit à ce sujet ! J'ai réussi à obtenir 2 dispositifs Potter la semaine passée... je vais retenter une approche diplomatique !
De plus, j'en ai besoin car sans un repère, je ne pourrais pas doser mon activité enzymatique (il me faut établir une droite standard pour y reporter mes valeurs expérimentales, tu vois ce que je veux dire ?)

Concernant mon protocole d'extraction, justement, rien n'est "bien" décrit dans la littérature si ce n'est que je reproduis au mot près ce qu'ils font en terme de centrifugation (ultracentrifugation) et autres paramètres. Mais dans la plupart des cas, c'est soit au mortier, soit dans un Potter pour le broyage. Ils n'utilisent pas de tampon de lyse, juste du PBS classique. Là je n'ai pas ma biblio mais je te donnerai une référence dès demain quand je serai au labo

[invite1c60740f]

Voici une référence que j'utilise pour réaliser mon protocole:
http://www.springerlink.com/content/...5/fulltext.pdf

Par ailleurs, j'ai testé hier mon protocole sur l'extraction d'enzymes végétales et j'obtiens des résultats plutot positifs ! je vais donc essayer d'appliquer ce protocole aux muscles. J'espère y arriver cette fois ! :-p