Bonjour à tous,
Le protocole que je dois utiliser pour extraire une enzyme de la chair d'un fruit implique l'ajout de BSA dans le tampon d'extraction.
Est-ce que quelqu'un sait pourquoi il faut ajouter du BSA?? A-til un rôle particulier de protection ou quelque chose comme ça???
Merci beaucoup de votre aide!
secot
Es tu sur que la BSA n'est pas uniquement utilisé pour réaliser une gamme étalon afin de doser tes protéines extraites?
certaines protéines (notamment les enzymes) ont de l'affinité pour certains matériaux (plastiques, d'autres protéines...)
Le rôle de la BSA est d'"occuper" ces sites afin d'éviter les interaction de ta protéine d'intérêt.
Merci Flyingbike!! C'est donc un protecteur!
Mais lorsque je dose ensuite mes protéines extraites, la BSA est utilisée dans la gamme étalon. Dans quelle mesure la BSA présente dans mes extraits (puisque dans le tampon d'extraction) ne va pas fausser la quantification des proteines extraites par la suite???
Pour bien faire les choses, tu devrais réaliser ta gamme BSA étalon dans le tampon d'extraction, comme ça plus de problème avec la BSA du tampon !
en fait c'est un peu compliqué: j'extrait avec un tampon Hepes-NaOH, MgCl2, EDTA, KCl, DTT, DIECA, PVPP, BSA.
Après je fais précipiter mes protéines à l'ammonium sulfate et je reprends le culot dans le tampon sans PVPP ni BSA.
J'allais donc réaliser ma gamme avec le tampon sans PVPP ni BSA.
Sauf que le BSA doit avoir précipité aussi et la reprise du culot va modifier la concentration en BSA "parasite"de mon extrait par rapport à la gamme étalon si je la fait dans mon tampon d'extraction (avec PVPP et BSA).
Vois-tu ce que je veux dire???
je vois oui... tu as quelle concentration finale en BSA dans le tampon ?
une solution serait de faire une "extraction témoin" sans échantillon que tu utiliserais pour faire la gamme, mais je n'ai aucune idée de si la quantité qui sera présente aura un impact sur le dosage...
Quel type de dosage ?
la concentration finale en BSA dans mon tampon d'extraction est de 1%.
Je fais un dosage en cinétique pour établir une activité enzymatique à 340nm.
Et un dosage des protéines extraites avec un Bradford modifié (RC DC biorad) à 750 pour pouvoir exprimer mes activités par quantité de prot extraites.
oui 1% c'est pas rien. Faut tenir compte de ça. Ma seule idée c'est celle de l'extraction à blanc, comme ça tu récupères autant de BSA que dans les échantillons. Sauf si tu as besoin d'une activité relative ou dans ce cas tu ne prends pas en compte l'activité absolue en fonction de la quantité de protéine totale.
Ben je vais essayer l'extraction à blanc alors!! Je verrais bien...
Merci beaucoup de ton aide!
