Bonjour à tous.
Voilà, j'ai un gros problème avec ce TP sur les récepteurs NMDA d'ovocyte injectés. Je joins le texte complet avec question et l'exercice qui va avec. Si quelqu'un peut me filer un coup de main, ce serait vraiment sympa. Sinon, m'indiquer quelqu'un qui pourrait m'aider.... ou quelque chose. Parce que je ne m'y connais pas trop. VOilà, merci beaucoup déjà de lire tout ça (parce que c'est assez long!) et bon courage, vraiment)
Tchao
Ifnie
Expression du récepteur NMDA dans l’ovocyte de Xénope.
Des ovocytes ont été injectés avec des ARNm codant pour le récepteur NMDA NR1/NR2A. Trois jours après injection, on étudie l’expression de ces ovocytes par la technique de voltage clamp à deux électrodes. Nous désirons déterminer les principales caractéristiques biophysiques et pharmacologiques de ces récepteurs.
On utilise une solution de Ringer (NaCl 100mM, KCl 2.5 mM, BaCl2 0.3mM, Hepes 5mM, pH7.3
Solution intrapipette : KCl 3M
En présence de 1/glutamate + glycine (100µM chacun)
2/ solution 1/ + APV 100µM
3/ solution 1/ + Magnésium 50µM
Q° :
1/ Quel est l’intérêt de l’ovocyte de Xénope en Neurobiologie ?
- sa taille = il est gros donc facilement manipulable
- 2 pôles visibles donc injection des ARN ou ADN dans le bon pôle plus évident
- Les ovocytes sont produits en nombreuse quantité et rapidement.
- …. ?
2/ Expliquer les différences d’expression des protéines entre des ovocytes injectés avec du ADNc et des ovocytes injectés avec de l’ARN ?
- …. ?
3/ Quelles sont les limites techniques de ce système d’expression ?
- Les ADNc ne sont pas intégrés au génome chez les cellules eucaryotes. Donc l’expression de protéines à partir de cet ADNc est temporaire. De même avec les ARN, qui seront forcément dégradés.
4/ Définir le terme : antagoniste compétitif.
- Substance qui inhibe l’activité d’un récepteur, en se liant avec lui de façon allostérique, avec une affinité de l’ordre de celle de l’agoniste de ce récepteur. L’agoniste et l’antagoniste entreront en compétition pour se lier au récepteur lorsqu’ils seront tous deux présents dans le milieu.
5/ Définir la notion de « courant voltage dépendant ».
- Le courant voltage dépendant définit un courant qui n’apparaît que lorsque le voltage est à un certain seuil. On verra un courant créer que si la cellule atteint une certain seuil de dépolarisation.
6/ Pourquoi utilise-t-on du KCl 3M dans les électrodes et non pas une solution ionique proche du milieu intérieur de l’ovocyte ?
- …. ?
7/ Quel est l’intérêt d’une solution Ringer contenant du Ba2+ à la place du Ca2+ ?
- Le Ca participe au courant créé. Il peut contaminer les mesures. (Canaux Ca voltage dépendant + canaux ioniques activés par le Ca, etc…)
8/ Définir le terme « n de Hill » ?
- …. ?
9/ Quelles expériences suggérez-vous pour démontrer que la molécule que vous utilisez est un antagoniste compétitif d’un récepteur ?
- Mettre l’agoniste marqué suivit de l’antagoniste froid et suivre la courbe d’évolution. Ou quelque chose comme ça.
10/ Pourquoi une sphère de même diamètre qu’un ovocyte présente une capacité membranaire bien plus faible que celle de l’ovocyte ?
- …. ?
12/ Citer d’autres systèmes d’expression comparables au système ovocytaire. Donner les avantages et inconvénients ?
- J’ai pensé aux bactéries et aux levures, mais…. Je sais pas.
13/ Le potentiel de repos d’un ovocyte exprimant des canaux K+ est plus hyperpolarisé que celui d’un ovocyte non injecté . Pourquoi ?
- La ddp d’une membrane résulte des équilibre des potentiels dus aux différents canaux de la membrane. La présence de canaux K+ déplace cet équilibre (ions K+ sortant = hyperpolarisation) vers l’hyperpolarisation.
14/ Pourquoi utilisons nous un amplificateur à deux électrodes plutôt qu’un amplificateur de patch clamp ? Donner les avantages et les inconvénients ?
- … ?
15/ Pouvons nous étudier les canaux unitaires présents sur les ovocytes ?
- je pense que oui, en patch clamp inside-out, outside-out, etc… non ?
EXERCICE :
On injecte à l’aide d’une µpipette des ARNs codant pour des récepteurs NMDA (NR1/NR2A) dans chaque ovocyte de Xénope. Les ovocytes sont maintenus dans des conditions de survie appropriées. Trois jours après l’injection, on teste les propriétés membranaires acquises par ces ovocytes en les comparant à celles d’ovocytes de même origine, conservés dans les mêmes conditions, mais non injectés. Dans ce but, les ovocytes sont introduits un à un dans une chambre Plexiglas et mis en perfusion continue avec une solution physiologique Ringer-Ba2+ (NaCl 100mM, KCl 2.8mM, Hepes 5mM, Ba2+ 0.3mM, pH7.3)
1/ Dire brièvement en vous limitant à l’essentiel quels évènements sont sensés survenir dans l’ovocyte après injection.
2/ En utilisant un amplificateur à deux électrodes, on applique aux ovocytes par une des µélectrodes une impulsion rectangulaire de courant de 10 nA pendant 1s. Grâce à la 2de µélectrode, mesurant le potentiel de membrane, on enregistre un saut de potentiel correspondant à l’impulsion. Mesuré au niveau stationnaire, le potentiel de membrane passe au cours du saut (valeurs moyennes) de –55 mV à –45 mV pour les ovocytes témoins et de –55 mV à –50 mV pour les injectés (75% des injectés, les 25% restant n’ayant pas répondu à l’injection d’ARN).
Calculer à partir des donnés la valeur des résistances de membrane des deux groupes d’ovocytes. (courbe avec allure ‘exponentielle’ au départ du saut et à la fin).
Proposez deux interprétations du changement de résistance observé.
Le changement de potentiel observé est exponentiel alors que le saut de courant est rectangulaire. Que représente la constante de temps de cette exponentielle ? Quelle information importante concernant les effets de l’injection sur la membrane ovocytaire peut en être déduite sachant que ces constantes de temps sont en moyenne 2 fois plus petites pour les ovocytes injectés que pour les témoins.
3/ En mode voltage clamp, on impose un potentiel de –60 mV à un ovocyte injecté. Après 5 minutes, on perfuse rapidement une solution de glutamate 100µM et glycine 100µM pendant 50 s. Puis l’ovocyte est perfusé en continu par une solution Ringer-Ba2+ contenant 10nM de Zn2+, on applique de nouveau une solution glutamate- glycine.
Dessiner et expliquer les résultats que vous espérez obtenir.
4/ On réalise une 2de série d’expériences. Le potentiel de membrane est maintenu à –60 mV. On enregistre le courant obtenu après application de la solution glutamate-glycine contenant 1mM de Mg2+.
Dessiner et expliquer les résultats que vous espéreriez obtenir.
5/ On réalise une 3ème série d’expériences. Le potentiel de membrane est maintenu à –60mV. L’expérimentateur a oublié d’ajouter du Baryum dans la solution Ringer. On enregistre le courant obtenu après application de la solution glutamate-glycine contenant 1 mM d’APV-5.
Dessiner et expliquer les résultats que vous espéreriez obtenir.
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Envoyé par ifnie 
