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Récepteurs NMDA



  1. #1
    ifnie

    Récepteurs NMDA


    ------

    Bonjour à tous.
    Voilà, j'ai un gros problème avec ce TP sur les récepteurs NMDA d'ovocyte injectés. Je joins le texte complet avec question et l'exercice qui va avec. Si quelqu'un peut me filer un coup de main, ce serait vraiment sympa. Sinon, m'indiquer quelqu'un qui pourrait m'aider.... ou quelque chose. Parce que je ne m'y connais pas trop. VOilà, merci beaucoup déjà de lire tout ça (parce que c'est assez long!) et bon courage, vraiment )

    Tchao
    Ifnie


    Expression du récepteur NMDA dans l’ovocyte de Xénope.

    Des ovocytes ont été injectés avec des ARNm codant pour le récepteur NMDA NR1/NR2A. Trois jours après injection, on étudie l’expression de ces ovocytes par la technique de voltage clamp à deux électrodes. Nous désirons déterminer les principales caractéristiques biophysiques et pharmacologiques de ces récepteurs.

    On utilise une solution de Ringer (NaCl 100mM, KCl 2.5 mM, BaCl2 0.3mM, Hepes 5mM, pH7.3

    Solution intrapipette : KCl 3M

    En présence de 1/glutamate + glycine (100µM chacun)
    2/ solution 1/ + APV 100µM
    3/ solution 1/ + Magnésium 50µM

    Q° :
    1/ Quel est l’intérêt de l’ovocyte de Xénope en Neurobiologie ?
    - sa taille = il est gros donc facilement manipulable
    - 2 pôles visibles donc injection des ARN ou ADN dans le bon pôle plus évident
    - Les ovocytes sont produits en nombreuse quantité et rapidement.
    - …. ?

    2/ Expliquer les différences d’expression des protéines entre des ovocytes injectés avec du ADNc et des ovocytes injectés avec de l’ARN ?
    - …. ?

    3/ Quelles sont les limites techniques de ce système d’expression ?
    - Les ADNc ne sont pas intégrés au génome chez les cellules eucaryotes. Donc l’expression de protéines à partir de cet ADNc est temporaire. De même avec les ARN, qui seront forcément dégradés.

    4/ Définir le terme : antagoniste compétitif.
    - Substance qui inhibe l’activité d’un récepteur, en se liant avec lui de façon allostérique, avec une affinité de l’ordre de celle de l’agoniste de ce récepteur. L’agoniste et l’antagoniste entreront en compétition pour se lier au récepteur lorsqu’ils seront tous deux présents dans le milieu.

    5/ Définir la notion de « courant voltage dépendant ».
    - Le courant voltage dépendant définit un courant qui n’apparaît que lorsque le voltage est à un certain seuil. On verra un courant créer que si la cellule atteint une certain seuil de dépolarisation.

    6/ Pourquoi utilise-t-on du KCl 3M dans les électrodes et non pas une solution ionique proche du milieu intérieur de l’ovocyte ?
    - …. ?

    7/ Quel est l’intérêt d’une solution Ringer contenant du Ba2+ à la place du Ca2+ ?
    - Le Ca participe au courant créé. Il peut contaminer les mesures. (Canaux Ca voltage dépendant + canaux ioniques activés par le Ca, etc…)

    8/ Définir le terme « n de Hill » ?
    - …. ?


    9/ Quelles expériences suggérez-vous pour démontrer que la molécule que vous utilisez est un antagoniste compétitif d’un récepteur ?
    - Mettre l’agoniste marqué suivit de l’antagoniste froid et suivre la courbe d’évolution. Ou quelque chose comme ça.

    10/ Pourquoi une sphère de même diamètre qu’un ovocyte présente une capacité membranaire bien plus faible que celle de l’ovocyte ?
    - …. ?

    12/ Citer d’autres systèmes d’expression comparables au système ovocytaire. Donner les avantages et inconvénients ?
    - J’ai pensé aux bactéries et aux levures, mais…. Je sais pas.

    13/ Le potentiel de repos d’un ovocyte exprimant des canaux K+ est plus hyperpolarisé que celui d’un ovocyte non injecté . Pourquoi ?
    - La ddp d’une membrane résulte des équilibre des potentiels dus aux différents canaux de la membrane. La présence de canaux K+ déplace cet équilibre (ions K+ sortant = hyperpolarisation) vers l’hyperpolarisation.


    14/ Pourquoi utilisons nous un amplificateur à deux électrodes plutôt qu’un amplificateur de patch clamp ? Donner les avantages et les inconvénients ?
    - … ?

    15/ Pouvons nous étudier les canaux unitaires présents sur les ovocytes ?
    - je pense que oui, en patch clamp inside-out, outside-out, etc… non ?


    EXERCICE :

    On injecte à l’aide d’une µpipette des ARNs codant pour des récepteurs NMDA (NR1/NR2A) dans chaque ovocyte de Xénope. Les ovocytes sont maintenus dans des conditions de survie appropriées. Trois jours après l’injection, on teste les propriétés membranaires acquises par ces ovocytes en les comparant à celles d’ovocytes de même origine, conservés dans les mêmes conditions, mais non injectés. Dans ce but, les ovocytes sont introduits un à un dans une chambre Plexiglas et mis en perfusion continue avec une solution physiologique Ringer-Ba2+ (NaCl 100mM, KCl 2.8mM, Hepes 5mM, Ba2+ 0.3mM, pH7.3)

    1/ Dire brièvement en vous limitant à l’essentiel quels évènements sont sensés survenir dans l’ovocyte après injection.

    2/ En utilisant un amplificateur à deux électrodes, on applique aux ovocytes par une des µélectrodes une impulsion rectangulaire de courant de 10 nA pendant 1s. Grâce à la 2de µélectrode, mesurant le potentiel de membrane, on enregistre un saut de potentiel correspondant à l’impulsion. Mesuré au niveau stationnaire, le potentiel de membrane passe au cours du saut (valeurs moyennes) de –55 mV à –45 mV pour les ovocytes témoins et de –55 mV à –50 mV pour les injectés (75% des injectés, les 25% restant n’ayant pas répondu à l’injection d’ARN).
    Calculer à partir des donnés la valeur des résistances de membrane des deux groupes d’ovocytes. (courbe avec allure ‘exponentielle’ au départ du saut et à la fin).
    Proposez deux interprétations du changement de résistance observé.

    Le changement de potentiel observé est exponentiel alors que le saut de courant est rectangulaire. Que représente la constante de temps de cette exponentielle ? Quelle information importante concernant les effets de l’injection sur la membrane ovocytaire peut en être déduite sachant que ces constantes de temps sont en moyenne 2 fois plus petites pour les ovocytes injectés que pour les témoins.

    3/ En mode voltage clamp, on impose un potentiel de –60 mV à un ovocyte injecté. Après 5 minutes, on perfuse rapidement une solution de glutamate 100µM et glycine 100µM pendant 50 s. Puis l’ovocyte est perfusé en continu par une solution Ringer-Ba2+ contenant 10nM de Zn2+, on applique de nouveau une solution glutamate- glycine.
    Dessiner et expliquer les résultats que vous espérez obtenir.

    4/ On réalise une 2de série d’expériences. Le potentiel de membrane est maintenu à –60 mV. On enregistre le courant obtenu après application de la solution glutamate-glycine contenant 1mM de Mg2+.
    Dessiner et expliquer les résultats que vous espéreriez obtenir.

    5/ On réalise une 3ème série d’expériences. Le potentiel de membrane est maintenu à –60mV. L’expérimentateur a oublié d’ajouter du Baryum dans la solution Ringer. On enregistre le courant obtenu après application de la solution glutamate-glycine contenant 1 mM d’APV-5.
    Dessiner et expliquer les résultats que vous espéreriez obtenir.

    -----

  2. Publicité
  3. #2
    Yoyo
    Citation Envoyé par ifnie
    Q° :
    1/ Quel est l’intérêt de l’ovocyte de Xénope en Neurobiologie ?
    - sa taille = il est gros donc facilement manipulable
    - 2 pôles visibles donc injection des ARN ou ADN dans le bon pôle plus évident
    - Les ovocytes sont produits en nombreuse quantité et rapidement.
    - …. ?
    - il permet l'expression hétérologue de gènes.
    - il possede toute la machinerie pour modifier post-traductionellement les proteines (phosphorylation, glycosidation etc...)
    2/ Expliquer les différences d’expression des protéines entre des ovocytes injectés avec du ADNc et des ovocytes injectés avec de l’ARN ?
    - …. ?
    ADNc: injection -> migration dans le noyau -> transcription -> exportation dans le cytoplasme -> traduction.
    ARN : injection -> traduction directe dans le cytoplasme.

    3/ Quelles sont les limites techniques de ce système d’expression ?
    - Les ADNc ne sont pas intégrés au génome chez les cellules eucaryotes. Donc l’expression de protéines à partir de cet ADNc est temporaire. De même avec les ARN, qui seront forcément dégradés.
    -Il peut etre necessaire pour l'activité de la proteine etudiee d'avoir des proteines accessoires, qui peuvent absentes chez le xenope.
    -Traduction peut efficace de certains ARNm du au biais de codons.
    -l'injection provoque l'entree massive d'ARN dans l'ovocyte, ce qui va aboutir a un surproduction de la proteine concernee. Ceci peut entrainer des biais si dans les conditions normales cette proteine est peu abondante.
    -presence des protéines endogenes de l'ovocyte, qui peuvent induire des erreurs de mesure.

    6/ Pourquoi utilise-t-on du KCl 3M dans les électrodes et non pas une solution ionique proche du milieu intérieur de l’ovocyte ?
    - …. ?
    Pour maintenir le potentiel de membrane. Si la concentration etait proche de la concentration interne ce potentiel n'existerait plus.

    7/ Quel est l’intérêt d’une solution Ringer contenant du Ba2+ à la place du Ca2+ ?
    - Le Ca participe au courant créé. Il peut contaminer les mesures. (Canaux Ca voltage dépendant + canaux ioniques activés par le Ca, etc…)
    Les canaux NMDA ne sont pas inhibés par le Ba2+, en revanche celui ci inhibe fortement les canaux Chlore endogene, qui sinon seraient responsables des courant de polarisation observes durant l'experience.
    9/ Quelles expériences suggérez-vous pour démontrer que la molécule que vous utilisez est un antagoniste compétitif d’un récepteur ?
    - Mettre l’agoniste marqué suivit de l’antagoniste froid et suivre la courbe d’évolution. Ou quelque chose comme ça.
    Plus simplement montrer qu'on observe une inhibition croissance des recepteurs en fonction de la concentration utilise. l'hinibition des recepteurs pouvant etre quantifiee par l'intermediaire du potentiel de membrane.
    10/ Pourquoi une sphère de même diamètre qu’un ovocyte présente une capacité membranaire bien plus faible que celle de l’ovocyte ?
    - …. ?
    Je ne sais pas, mais ca me fait penser aux question sur les microvillosites, qui augmentent la surface d'echange en limitant la taille des membranes... mais je ne sais pas si l'ovocyte possede de telles microvilosites.
    12/ Citer d’autres systèmes d’expression comparables au système ovocytaire. Donner les avantages et inconvénients ?
    - J’ai pensé aux bactéries et aux levures, mais…. Je sais pas.
    Je pense que ca conviens. Inconvenients des bacteries, c'ets un systeme procaryote (donc signaux de traduction differents, pas de modification post-traductionelles des proteines. etc..) avantage: possibilite de secretion des proteines, production en masse... etc...
    pour la levure, systeme euk, donc les modifications post-traductionnelles existent. par contre les proteines peuvent etre plus difficile a purifier.
    Ce sont des organismes vivants posseddant leur propre proteines, donc cela peut gener les observation, ensuite la proteine que l'on etudie peut etre toxique pour al cellule, auquel cas elle va mourrir empechant toute observation.

    Voila pour ma contrib'

    Bon courage
    Yoyo

  4. #3
    ifnie
    Salut

    Merci beaucoup pour ton aide. J'avais peur que personne ne lise mon truc, parce que c'est long et plutôt rébarbatif (pour moi). Alors merci beaucoup.

    Tcho
    Ifnie

  5. #4
    kinette
    Bonjour,
    Personnellement j'ai lu mais ça me dépasse un peu...

    Je peux juste ajouter ceci:

    2/ Expliquer les différences d’expression des protéines entre des ovocytes injectés avec du ADNc et des ovocytes injectés avec de l’ARN ?
    - …. ?

    ADNc: injection -> migration dans le noyau -> transcription -> exportation dans le cytoplasme -> traduction.
    ARN : injection -> traduction directe dans le cytoplasme.
    Du coup ça doit changer le temps à partir duquel le récepteur arrive dans la membrane (plus de temps pour l'ADNc) et aussi le temps d'expression (je ne sais pas qu'est-ce qui est dégradé en premier de l'ADN ou ARN...).

    Tu es en quelle formation, par curiosité?
    (pour moi tout ça est bien loin...)

    K.lamp
    Nomina si nescis, perit et cognito rerum.

  6. #5
    ifnie
    Merci aussi pour ton aide. Oui, le temps sera plus long avec l'ADNc qu'avec l'ARN. J'y avais pas pensé. Merci. Mais je ne sais pas lequel de l'aDN ou de l'ARN est dégradé en premier. Je pencherai pour l'ARN parce qu'il y a beaucoup de RNAse dans le cytosol... alors peut-être. Je sais pas.

    Pour répondre à ta question, je suis en maîtrise biologie cellulaire et physiologie. Voilà. Et ce TP... est une horreur pour chacun d'entre nous (dans la maîtrise) donc on essaye de se débrouiller un peu et on se refile nos infos.

    Tchao
    Ifnie

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Etoile
    Citation Envoyé par Yoyo
    10/ Pourquoi une sphère de même diamètre qu’un ovocyte présente une capacité membranaire bien plus faible que celle de l’ovocyte ?
    - …. ?
    Je ne sais pas, mais ca me fait penser aux question sur les microvillosites, qui augmentent la surface d'echange en limitant la taille des membranes... mais je ne sais pas si l'ovocyte possede de telles microvillosites.
    Hum je pense qu'il faudrait préciser si c'est une sphère avec une membrane ou pas, je ne comprend pas à la formulation de la question si c'est le cas ou pas.
    La capacité membranaire d'une cellule est due aux lipides qui forment la bicouche lipidique (ils ne sont pas conducteurs). Donc si la sphère n'est pas constituée d'une bicouche, c'est ça la différence avec l'ovocyte pour la capacité membranaire.
    Les protéines de la membrane, elles, sont conductrices et présentent une résistance. La capacité totale de la membrane peut donc varier selon la quantité de protéines présentent dans cette membrane. Dans ce cas, si la sphère est en fait une bicouche lipidique sans protéines, elle peut avoir une capacité membranaire parce qu'elle n'a pas de protéines membranaires alors que l'ovocyte en a. (Ca j'en suis pas sûre)
    Un autre point qui peut peut-être jouer : dans la membrane d'un ovocyte il y a des canaux ioniques et aussi des transporteurs actifs d'ions qui permettent de maintenir le potentiel de membrane, dans une sphère il n'y en a pas...
    *Etoile*

  9. Publicité
  10. #7
    kinette
    Bonjour,
    Je suis d'accord que cette question est vraiment mal formulée...

    Un autre point qui peut peut-être jouer : dans la membrane d'un ovocyte il y a des canaux ioniques et aussi des transporteurs actifs d'ions qui permettent de maintenir le potentiel de membrane, dans une sphère il n'y en a pas...
    J'aurais aussi répondu ça...

    K.opieuse...
    Nomina si nescis, perit et cognito rerum.

  11. #8
    Yoyo
    Citation Envoyé par kinette
    Bonjour,
    Je suis d'accord que cette question est vraiment mal formulée...

    Un autre point qui peut peut-être jouer : dans la membrane d'un ovocyte il y a des canaux ioniques et aussi des transporteurs actifs d'ions qui permettent de maintenir le potentiel de membrane, dans une sphère il n'y en a pas...
    J'aurais aussi répondu ça...

    K.opieuse...
    oui c'est en effet tres probablement la bonne reponse! j'avais lu la question de travers ops:

    ca m'apprendra


    yoyo

  12. #9
    ifnie
    Salut

    Pour la capacité, on m'a expliqué que c'était proportionnelle à la surface. Donc une sphère simple a une surface moins grande que celle d'un ovocyte qui lui, a des villosités, peut augmenter sa surface membranaire en fusionnant des vésicules du cytosol, etc... Peut-être que ça participe aussi.

    En tout cas, merci à tous.
    Ifnie

  13. #10
    JPL
    Citation:

    6/ Pourquoi utilise-t-on du KCl 3M dans les électrodes et non pas une solution ionique proche du milieu intérieur de l’ovocyte ?
    - …. ?

    Pour maintenir le potentiel de membrane. Si la concentration etait proche de la concentration interne ce potentiel n'existerait plus.
    Pour autant que je me souvienne on utilise une solution de KCl parce que les 2 ions diffusent à la même vitesse, ce qui ne serait pas le cas avec un mélange d'ions divers. Il apparaîtrait alors un potentiel de diffusion qui viendrait fausser la mesure.
    Rien ne sert de penser, il faut réfléchir avant - Pierre Dac

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