Etude des partenaires protéiques : Co-Immunoprécipitation, Tap-Tag et double hybride

[invite53399861]

Bonjour tous le monde,
J'ai un examen très bientôt pour obtenir une bourse pour le doctorat. J'ai vraiment besoin d'aide!
Je comprends très bien le principe du double hybride, cependant, je travaillerai sur un bactérie, mais mes analyses en double hybride devront-ils se faire chez la levure forcément? Pas dans la cellule hôte? De plus, comment peut-on automatiser la création des protéines recombinantes?

Quelqu'un connaîtrai les avantages et les incovénients des trois méthodes à savoir : co-immunoprécipitation, double hybride et tap-tag?

Pour le tap-tag, qu'elle est l'intérêt de passer par deux colonnes de chromato? Après l'utilisation de la TEV, reste-t-il des contaminants?

Je vous remercie d'avance pour votre aide.

Passez une agréable journée.
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[invite53399861]

J'aurais également voulu savoir comment peut-on réaliser les protéines fusions?

Et je me posais la question de savoir quel type d'anticorps fallait-il utiliser pour la Co-Ip? Un anticorps poly ou monoclonal? Si j'utilise un anticorps polyclonal, il risque de se fixer un peu partout sur ma protéine et je risque d'empêcher les interactions!?

[invite53399861]

Please Help

[Flyingbike]

pour créer une protéine de fusion, il te faut les cDNA des deux protéines. Tu les insere dans un vecteur à la suite, en prenant soin de les mettre en phase et en supprimant le codon stop de la premiere, comme ça tout est traduit en une fois. A ma conaissance on fait du double hybride chez la levure puisque ca n'est pas un procaryote. Pour l'IP, ça dépend des protéines il n'y a pas de règle absolue, mais il est vrai qu'n monoclonal peut masquer un potentiel site d'interaction avec une autre protéine.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite53399861]

Et le vecteur utilisé pour le clonage, de quoi s'agit-il? Plasmide, cosmide, YAC? Et comment ce vecteur s'exprime chez la levure? Le gène rapporteur, il se situe où? Il faut forcément que l'organisme qui exprime les protéines fusions soit un eucaryotes?
La protéine dont je devrait étudier les partenaires provient d'un procaryote et possède un signal peptide de localisation périplasmique. Je dois donc faire une protéine recombinante du côté C-Terminal, puisque la séquence sera clivée! Cela est-il possible?

[invite53399861]

Bonjour,
Quelqu'un pourrait m'aider? Merci
Bonne journée

[Zellus]

Salut,

Je comprends très bien le principe du double hybride, cependant, je travaillerai sur un bactérie, mais mes analyses en double hybride devront-ils se faire chez la levure forcément? Pas dans la cellule hôte?

Eh bien le système de double hybride a justement été inventé dans la levure et à ma connaissance ça ne se fait pas chez un autre organisme (pour le moment en tout cas). Car il a fallu tout mettre en place pour que ça marche : la souche de levure, les vecteurs ... Et il est facile et rapide de suivre la croissance de la levure sur boîte.

Quelqu'un connaîtrai les avantages et les incovénients des trois méthodes à savoir : co-immunoprécipitation, double hybride et tap-tag?

Ce qui me vient à l'esprit là de suite (cad à 5h du mat ) :

• co-immunoprécipitation : technique in vivo donc c'est bien, il y a le problème des anticorps qui peuvent en effet prendre un site de fixation d'un partenaire de la protéine
• double hybride : c'est bien parce que on peut tester plein de choses et ça peut donner des pistes si on n'a pas d'idée de partenaire à priori, mais c'est du in vitro, c'est chiant et long à mettre en place, et comme toutes les techniques haut débit il y a toujours des faux positifs
• tap-tag : c'est de l'in vivo aussi, y a pas le problème des anticorps comme l'IP, et c'est bien pur grâce à l'utilisation de deux colonnes justement, mais après c'est fait avec une protéine de fusion donc ça peut aussi changer l'interaction ...

Et le vecteur utilisé pour le clonage, de quoi s'agit-il? Plasmide, cosmide, YAC?

C'est généralement un plasmide tout simplement.

Et comment ce vecteur s'exprime chez la levure?

Ben comme pour la bactérie, il y a une origine de réplication pour la levure.

Le gène rapporteur, il se situe où?

Le gène de sélection tu veux dire ? Sur le plasmide ...

Il faut forcément que l'organisme qui exprime les protéines fusions soit un eucaryotes?

Non les protéines de fusion ça se fait très bien chez les bactéries aussi.

La protéine dont je devrait étudier les partenaires provient d'un procaryote et possède un signal peptide de localisation périplasmique. Je dois donc faire une protéine recombinante du côté C-Terminal, puisque la séquence sera clivée! Cela est-il possible?

Oui.

[invite53399861]

Pour le double hybride, est-il possible de l'effectuer avec une protéine possédant un signal peptide de localisation périplasmique? Celui-ci ne sera pas coupé?