Plasmide

[invite8119a28a]

Bonjour,
j'ai un petit problème pour effecteur mon compte rendu de TP.

Je dois effectuer une carte de restriction d'un plasmide avec son insert.
Je dispose de deux enzymes de restrictions, une XhoI qui possède deux site de restriction dans la cassette de polyclonage. l'autre enzyme est MluI cependant sur le schema du plasmide je n'ai pas son site de restriction donc je ne sais pas ou elle coupe.

Dans un premier temps, on effectue 2 digestions simples, une avec XhoI et la deuxieme avec MluI.
Dans un deuxieme temps on effectue une digestion double avec les deux enzymes de restriction.

Ensuite nous déposons les digestions réalisées sur un gel d'electrophorese, puis nous preparons un marqueur de taille et egalement un plasmide natif mais non digéré qui contient 2µL du plasmide, 8µL d'eau stérile et 1µL de tampon de depot.

Mais mon problème c'est que je ne sais pas si un plasmide natif est un plasmide seul sans insert ou justement si c'est le plasmide plus l'insert.

est ce que quelqu'un pourrai m'eclairer svp?
merci de votre aide.
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[invitee863e61a]

Bonjour,
j'ai un petit problème pour effecteur mon compte rendu de TP.

Je dois effectuer une carte de restriction d'un plasmide avec son insert.
Je dispose de deux enzymes de restrictions, une XhoI qui possède deux site de restriction dans la cassette de polyclonage. l'autre enzyme est MluI cependant sur le schema du plasmide je n'ai pas son site de restriction donc je ne sais pas ou elle coupe.

Dans un premier temps, on effectue 2 digestions simples, une avec XhoI et la deuxieme avec MluI.
Dans un deuxieme temps on effectue une digestion double avec les deux enzymes de restriction.

Ensuite nous déposons les digestions réalisées sur un gel d'electrophorese, puis nous preparons un marqueur de taille et egalement un plasmide natif mais non digéré qui contient 2µL du plasmide, 8µL d'eau stérile et 1µL de tampon de depot.

Mais mon problème c'est que je ne sais pas si un plasmide natif est un plasmide seul sans insert ou justement si c'est le plasmide plus l'insert.

est ce que quelqu'un pourrai m'eclairer svp?
merci de votre aide.

Puisque tu n'a aucune info sur l'insert, il semblerait logique que le terme "natif" renvoie au plasmide avec insert (celui que tu as digéré) non digéré. Essaie de faire l'exercice avec ce postulat

[invite8119a28a]

merci beaucoup, je suis partie sur cette base la et ça marche,
j'ai aussi une question : peut on determiner l'orientation de l'insert dans le plasmide, je ne sais pas comment repondre a cette question.
comment je peux faire pr savoir?
encore merci pour votre aide

[Flyingbike]

oui tu peux, sous certaines conditions. Il faut un site de restriction dans le vecteur, et un autre dans l'insert (pas au milieu de l'insert). Selon que l'insert est dans un sens ou dans l'autre, tu auras deux fragments différents en taille. Pour l'histoire du plasmide natif j'aurais dit que c'etait le vecteur seul...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee863e61a]

merci beaucoup, je suis partie sur cette base la et ça marche,
j'ai aussi une question : peut on determiner l'orientation de l'insert dans le plasmide, je ne sais pas comment repondre a cette question.
comment je peux faire pr savoir?
encore merci pour votre aide

Dans l'absolu, tu peux aussi le faire par PCR, avec une amorce dans l'insert, l'autre dans le vecteur. Cela dépend comment est formulé ton énoncé, s'il laisse entendre que c'est d'après les données de l'énoncé ou si c'est une question d'ouverture.
Bon courage