Concentration dosage ARN

[invitee170a0e7]

Bonjour à tous
Je viens vers pour une question somme toute très simple, et pourtant je me doute...

Après une extraction d'ARN, vient le moment fatidique de les doser ! Jusqu'ici pas de soucis :
Je prend 5ul de mes échantillons, que je met dans 495ul d'eau (donc Vf de 500ul). Puis je passe à 260 et 280nm.
Mes rapports sont plutôt bon (entre 1,85 et 1,97), mais vient la question du "Et alors t'as combien en concentration ?"

Je sais qu'une unité d'absorbance à 260nm est égale à 40ug/mL d'ARN.
Donc pour savoir la concentration des mes ARN :

[echantillon] = Absorbance x 40 x FD

FD étant le facteur de dilution. Sauf que c'est justement là où je coince étrangement
J'ai mis 5 dans 500... donc le FD devrait être de 100 non ?
Dans ce cas je trouve des concentrations de près de 2000ug/mL ça me parait juste énorme.... Donc je me plante surement quelques parts.

Merci d'avance pour votre aide
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[Flyingbike]

c'est pas impossible, ça fait 2000ng/µL. Selon le tissu et la technique d'extraction tu peux tout a fait obtenir ça.

C'est quoi comme ARN et comme extraction ?

[invitee170a0e7]

Extraction d'ARN (totaux j'imagine) à partir de protoplastes, à l'aide du kit Nucelospin Plant II (Macherey-Nagel).

J'avais un bon rendement pour mes protoplastes donc j'imagine que j'ai aussi pas mal d'ARN.

2000ng/ul... ça ne ferait pas 2ug/ul par hasard ?...
Parfois je me demande si prendre une pause de 10/15min et de revenir sur le problème après ne serait pas mieux!

Effectivement 2ug/ul ce n'est pas impossible, cela arrive relativement souvent à partir de protoplastes (d'après la littérature).
Et bien merci du coup de main !


edit : sinon pour vérifier si mes ARN ne sont pas trop dégradé, j'envisage de faire un gel non-dénaturant. Hormis des précautions style ARN dans la glace/port des gants/etc... des avis sur cette méthode ?
Si je lave ma cuve d'électrophorèse avec du SDS 10%, et que je rince à l'eau DEPC... que j'utilise que des erlens/éprouvette stérile, que je fait mon tampon de migration avec de l'eau DEPC. Croyez-vous que cela sera suffisant pour éviter les dégradations ?

[invite853321bf]

Ben normalement t'auras un smear si t'arrives à le voir, avec deux bandes plus intenses en bas de ton gel correspondant aux ARN ribosomiques (toujours dans le cas où t'arrives à les voir). Dire s'ils sont dégradés ou pas à partir d'un smear...

Ca me parait juste énorme d'avoir de telles concentrations grâce à un kit commercial. J'avais des rendements dans ces eaux là mais par la bonne vieille méthode de l'extraction au phénol, mes rendements par kit étaient beaucoup moins importants.
Une autre explication possible serait que ta DO soit très faible et que tu ne sois donc pas dans la relation linéaire.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee170a0e7]

C'est bon, je les vois bien
Il m'a suffit de travailler proprement et c'est tout. Ouf !

Sinon pour mes concentrations, mes DO à 260 tournent entre 0,6 et 0,8... J'ai battu le record de l'année au labo', mais vu que je pars à partir de protoplastes (cellules végétales sans paroi) ce n'est pas si étonnant d'après le "M. Record" du labo. Moi aussi ça me laissait un peu perplexe. En tout cas, les RT derrières étaient nickel