Amplification et purification de plasmide

[invitef454cee4]

Bonjour,

Suite à des difficultés d'amplification et de purification de plasmides, je me pose quelques questions auxquelles peut-être quelqu'un saura répondre:
- Pendant combien de temps les antibiotiques (ampi, kana) sont-ils "actifs" en milieu liquide et gélosé?
- Et donc combien de temps sont "utilisables" des colonies pour des midiprep?
- Si j'introduis un plasmide pEGFP-N1 (Clontech) dans des DH5a, celles-ci seront-elles vertes sous UV ou pas forcément?
- La conservation de bactéries transformées dans 25% final de glycérol à -80°C vous semble t'il être un bon moyen de conservation?
- Et enfin que feriez-vous si après avoir commandé des milieux, antibios et kit neufs vous n'obteniez que 25 µg de plasmide au lieu de 250 µg comme le dit le protocole du kit de purif (Pureyield midiprep de Promega)

Merci d'avance pour vos réponses

Cordialement
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[Flyingbike]

- Pendant combien de temps les antibiotiques (ampi, kana) sont-ils "actifs" en milieu liquide et gélosé?

c'est pas très solide, il vaut mieux rajouter l'antibio au dernier moment, et surtout pas a haute température pour les milieux gélosés (<50°). Si tu parles de temps de culture, en général on ne cultive pas des jours et des jours.

- Et donc combien de temps sont "utilisables" des colonies pour des midiprep?

des semaines si tu gardes tes boites/tubes a +4

- Si j'introduis un plasmide pEGFP-N1 (Clontech) dans des DH5a, celles-ci seront-elles vertes sous UV ou pas forcément?

ca dépend du promoteur, de s'il est capable de s'exmprimer chez les procaryotes. En tout cas il faut exciter a la bonne longueur d'onde (488nm) et filtrer la lumiere d'émission (505 je crois). Je ne sais pas si ça le fait sous une lampe UV classique

- La conservation de bactéries transformées dans 25% final de glycérol à -80°C vous semble t'il être un bon moyen de conservation?

ca se garde des années dans ce cas

- Et enfin que feriez-vous si après avoir commandé des milieux, antibios et kit neufs vous n'obteniez que 25 µg de plasmide au lieu de 250 µg comme le dit le protocole du kit de purif (Pureyield midiprep de Promega)

ca dépend du plasmide, mais je surveillerai la croissance bactérienne avant la midiprep pour l'arreter au bon moment. Tu es partie de combien de bactéries ?

[invitef454cee4]

c'est pas très solide, il vaut mieux rajouter l'antibio au dernier moment, et surtout pas a haute température pour les milieux gélosés (<50°). Si tu parles de temps de culture, en général on ne cultive pas des jours et des jours.

Oui ça je sais qu'il faut mettre l'antibio au dernier moment et pas dans le milieu trop chaud, mais je me demandais combien de temps il reste actif une fois dans le milieu.

des semaines si tu gardes tes boites/tubes a +4

Ok mais est-ce que le plasmide ne risque pas de "sortir" des bactéries au bout d'un moment

ca dépend du promoteur, de s'il est capable de s'exmprimer chez les procaryotes. En tout cas il faut exciter a la bonne longueur d'onde (488nm) et filtrer la lumiere d'émission (505 je crois). Je ne sais pas si ça le fait sous une lampe UV classique

Il y a forcément un promoteur procaryote puisque le gène de résistance à l'antibio est exprimé mais je ne sais pas si il peut permettre aussi l'expression de la GFP

ca dépend du plasmide, mais je surveillerai la croissance bactérienne avant la midiprep pour l'arreter au bon moment. Tu es partie de combien de bactéries ?

J'ai suivi le protocole de purif à la lettre à savoir: repiquer une colonie dans 5ml de LB+antibio pour faire une préculture sur 8h, diluer au 1/500 et incuber la nuit à 37°C et faire la purif quand la DO600nm est entre 2 et 4

[Flyingbike]

Il y a forcément un promoteur procaryote puisque le gène de résistance à l'antibio est exprimé mais je ne sais pas si il peut permettre aussi l'expression de la GFP

Attention, la GFP peut etre sous le contrôle d'un promoteur totalement différent de celui du gène de resistance...

J'ai suivi le protocole de purif à la lettre à savoir: repiquer une colonie dans 5ml de LB+antibio pour faire une préculture sur 8h, diluer au 1/500 et incuber la nuit à 37°C et faire la purif quand la DO600nm est entre 2 et 4

tu as un bon culot de bactéries ? sinon la méthode du chloramphénicol peut peut etre te sauver

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef454cee4]

Pour ce qui est de la GFP je me disais juste que si mes bactéries sont vertes c'est qu'elles ont bien intégré le plasmide mais vu qu'elles poussent en présence d'antibio c'est que c'est bon. Comme elles ne sont pas vertes je pense que c'est juste qu'il n'y a pas de promoteur procaryote pour la GFP dans mon plasmide.
Les culots de bactéries je les trouve pas énormes mais j'ai peur de saturer les colonnes de purif avec trop de bactéries si je dilue moins la préculture, ou trop de plasmides en utilisant du chloramphénicol. Je vais refaire la manip cette semaine en eluant avec un plus grand volume d'eau et en précipitant à la fin pour reconcentrer mon plasmide et je verrai bien si j'en ai plus cette fois.
En tout cas merci beaucoup pour ton aide.

[inviteb94d8e21]

Bonjour,

Suite à des difficultés d'amplification et de purification de plasmides, je me pose quelques questions auxquelles peut-être quelqu'un saura répondre:
- Pendant combien de temps les antibiotiques (ampi, kana) sont-ils "actifs" en milieu liquide et gélosé?

Bonjour,

Sans bactéries, plusieurs semaines. Si des bactéries résistantes recrachent une enzyme comme la bêta-lactamase, tu peux épuiser un milieu liquide en quelques heures. C'est la diffusion de cette enzyme sur les milieux gélosés qui est responsable de l'apparition de colonies "satellites" sur les boîtes ampi qu'on a oublié à 37°C pendant le week-end...

- Et donc combien de temps sont "utilisables" des colonies pour des midiprep?

Mon record personnel est 3 mois (à 4°C). Bactéries repiquées au milieu d'un superbe champignon jaune citron.

- Si j'introduis un plasmide pEGFP-N1 (Clontech) dans des DH5a, celles-ci seront-elles vertes sous UV ou pas forcément?

Il n'y a pas de promoteur procaryote devant la GFP sur ce vecteur. Ceci dit, le gène KanR est dans la même orientation que le gène GFP et il est possible que la GFP s'exprime à partir d'un polycistron. La réponse est donc : il faut essayer pour le savoir.

- La conservation de bactéries transformées dans 25% final de glycérol à -80°C vous semble t'il être un bon moyen de conservation?

Y'a pas mieux (à part l'azote liquide, peut-être, mais c'est du gâchis).

- Et enfin que feriez-vous si après avoir commandé des milieux, antibios et kit neufs vous n'obteniez que 25 µg de plasmide au lieu de 250 µg comme le dit le protocole du kit de purif (Pureyield midiprep de Promega)

De deux choses l'une : soit ta combinaison plasmide/bactérie donne un faible rendement, soit ta technique de purif ne marche pas. Je te conseille de garder un aliquot (1.5ml) de tes bactéries avant de les lyser pour ta prep sur colonne. Fais une miniprep classique sur cet aliquot (lyse alcaline + isopropanol) et estime ton rendement en plasmide. Ca t'indiquera si c'est un problème de rendement de plasmide au cours de la croissance bactérienne ou si tu perds ton plasmide pendant la purification.

Bien cordialement

[Jean-Luc P]

le plasmide pegfp-n1 a un promoteur eucaryote pour la protéine fusionnée à la GFP.

Les colonies positives ne seront pas fluorescentes.

Par contre le gène de sélection kana/neo est sous double promoteur pro/eucaryote.

[invitef454cee4]

Bonjour,
J'ai fais un test de purif en combinant les réactifs du kit et une extraction au phénol chloroforme sur 1.5ml de précultures que j'avais gardées et j'ai obtenu de 20 à 80 µg de plasmides. Visiblement mon problème venait de la purif, les colonnes ont peut-être été saturées par trop de bactéries.
C'est peut-être moins propre, je vais voir comment réagissent mes cellules.
En tout cas mon problème est réglé (pour l'instant) rien ne vaut un bon vieux protocole "maison"
Merci à tous pour vos conseils

[invitec9f0f895]

salut

content que t'es résolu ton probleme. Sinon une rapide réponse sur quelques point.
Les boites a 4°c avec antibio se gardent des semaines entieres. Par contre l'ampicilline est sensible a la chaleur, donc pas possible de les cultiver trop longtemps a 37.
Sinon quand on veut améliorer les rendements de miniprep tu peux mettre du chloramphénicol quelques heures avant la fin de ta culture. Il va bloquer la multiplication bactérienne, sans affecter la replication du plasmide. Ainsi le nombre de copie du plasmide dans la bactérie augmente considérablement

Ah oui souvent quand les miniprep sont pas bonnes c'est l'etape de lyse qui n'est pas complète.

Yoyo

[invitee170a0e7]

Sinon quand on veut améliorer les rendements de miniprep tu peux mettre du chloramphénicol quelques heures avant la fin de ta culture. Il va bloquer la multiplication bactérienne, sans affecter la replication du plasmide. Ainsi le nombre de copie du plasmide dans la bactérie augmente considérablement

c'est un bon truc à savoir
pourrais-tu en donner l'explication ? (ainsi que le volume à mettre dans la pré-culture ^^).

Sinon, je profite un peu du sujet... Dans certains protocoles de miniprep par lyse alcaline, la première solution (celle pour re-suspendre les culots bactériens) contient du glucose (classiquement, du TEG), d'autres juste du TE... que fais le glucose à cette étape ? Un rapport avec l'osmolarité ?

merci