Mutagenèse: Pb...

[invite2b117f7b]

Bonjour à tous.

Voilà je viens à vous car j'ai un petit problème et j'aimerai avoir votre aide. J'ai fait une mutagenèse dirigée où la résultante est la modification d'un unique acide aminé de la RNAse-L. Puis une transformation dans des XL1 et une culture sur milieu avec ampicilline. Au final, je n'ai eu aucune culture.

J'ai répété la manip deux fois, en vérifiant pour la première (j'ai gardé les mêmes paramétres) et en modifiant la température dhybridation pour la seconde (j'ai abaissé la température).

voici le protocole que j'ai appliqué:

Dans un premier temps, je fais une PCR avec :
- 50 ng d'ADN plasmidique (RNase-L+ gène resistance ampi)
- 1 miicroL de chaque amorce (sens et anti-sens).
Les amorces sont de 21bp avec la base à muter au centre
- des dNTP à 0.5mM
- 5µl de tampon 10X (contenant les sels)
- qsp 50µl

Ensuite ben je fais la première dénaturation pendant 1min à 95°C

+1µl de Pfu Ultra High Fidelity DNA polymerase (Stratagene)
Puis 16 cycles :
dénaturation 95°C 30s / Annealing 60°C 1min / Extension 68°C 8 min 30 (plasmide de 7kb)

Conservation sur la nuit à 4°C (dans le thermocycler)

Le lendemain c'est la digestion du plasmide méthylé:

- produit de la PCR + ajoute 1µl de DpnI (10U)
- Mélange à l'aide de la pipette
- Bain-marie à 37°C pendant 2h

Ensuite vient la transformation
- 50µl de bactéries XL1 + 1µl de produit de la digestion
- Plonge dans la glace pendant 30min
- puis dans bain-marie à 42°C pendant 45s
- Remets dans la glace 2 min
- Ajoute 0.5ml de LB chaud
- Incube 1h à 37°C sous agitation

Puis mise en culture 250µl sur LB-Ampi à 37°C sur la nuit...

AUCUNE CULTURE!!

Alors au départ je me suis dit j'ai du oublié quelque chose, mais non puis que le résultat est le même.

Et j'ai pensé que ca pouvait être un mutagène toxique pour les bactéries. 5le truc c'est que j'ai rien pour etayer cela, d'autant plus que chez l'humain cette mutation inactive la RNAse-L).

Quelqu'un aurait-il une piste ou une idée de la cause d'absence de culture?
Merci.
-----

[Flyingbike]

euh un plasmide digéré ne peut pas s'exprimer dans une bactérie... Il faut que la construction soit circulaire...

[invite2b117f7b]

euh un plasmide digéré ne peut pas s'exprimer dans une bactérie... Il faut que la construction soit circulaire...

Excuse-moi j'ai du mal m'exprimer, on digére par DpnI le plasmide méthylé et donc non muté (le plasmide parent si tu préfère). Le plasmide muté quant à lui reste en théorie intacte.

[Flyingbike]

as tu essayé de transformer tes bactos avec le plasmide natif ?
As tu vérifié ton produit de PCR sur gel ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite2b117f7b]

as tu essayé de transformer tes bactos avec le plasmide natif ?
As tu vérifié ton produit de PCR sur gel ?

En fait en faisant d'autres mutations sur la même matrice d'ADN, on observe des clones bactériens. De même une PCR screen de ces mêmes clones montrent la présence du plasmide.
Il n' y a que cette mutation qui ne donne rien. Et pour répondre à ta question je n'ai pas fait de vérification sur gel de mon produit PCR ni une transfo par le plasmide natif (pour un tas de raisons)

[Flyingbike]

alors tu devrais commencer par verifier ta pcr. Tu es sure de la spécificité de tes amorces ?

[invite2b117f7b]

alors tu devrais commencer par verifier ta pcr. Tu es sure de la spécificité de tes amorces ?

Merci pour ton aide ( à chaque fois j'oublie dslée).
Je suis sûre de leurs spécifité. En revanche, je ne pourrais pas recommencer ma pcr vu que je suis engagé dans un autre truc. La raison pour laquelle je n'ai pas vérifier est que je n'avais pas assez de matériel (pour tout ce qui était prévu).

[invite6d14e0f5]

bonsoir,
- un dépôt sur gel ne servira a rien, puisque c'est une mutagenese et non pas une amplification. 50 ng = non visible sur gel.
proposition:
- augmenter le tps de denaturation jusqu'a 5 min 95C. les oligos auront du mal a se fixer si la denaturation n'est pas suffisante.
- 1h de dpnI suffit = gain de temps.
- mais 1ul ne suffit pas pr une transfo, normalement j''utilise 10ul de ma mutagenese.
- regeneration ne sert a rien tant que l'antibio est de l'ampi = ne bloque pas la traduction = gain de tps.
- a la fin, vs dtes aucune culture = aucun clone sur boite puisque la transfo vs l'etalez sur boite LBA?

[Flyingbike]

50ng ca peut très bien se voir sur gel... Moi je quantifierais le produit soit sur gel soit en spectro avant la transfo. Pour la transfo c'est la quantité qui compte, moins de 10ng c'est largement suffisant en général.

[invite6d14e0f5]

excuse moi mais 50 ng ne peut pas être vue sur gel, mais en spectro évidemment que ca fonctionne.
pr ce qui est de la transfo, moins de 10ng est une quantite largement suffisante pr faire une propagation (etaler un vecteur sur boite pr en piquer un clone, ou pr une transfo classique j'utilise 10ng), mais pr une transformation de mutagenese, ce n'est pas du tout suffisant!!
je suis certain de ce que je vs dis. vs avez juste a verifier en utilisant ++.

[Flyingbike]

Si, 50ng c'est largement suffisant pour etre visible sur gel, avec du GelRed et même en BET (je l'ai encore fait ce matin, promis ça marche).

[invite6d14e0f5]

ne te concentre pas sur l'idee des 50 ng. ce que je veux dire que 50 ng de vecteur seul pr une reaction de ligation est suffisante, mais pas pr une mutagenese.
ds tous les cas, essayer et vs verrez. qu'est ce que vs faites avec tout le produit de PCR et dnpI, si vs en utilisant 1 ul!!

[invite6d14e0f5]

je viens de demander a des collegues du labo, ils utilisent egalement 5-10 ul du produit de dpnI. ils trouvent que 1 ul c'est trop leger!!

[invite71f23525]

C'est bien joli d'avoir des idées fixes sur les protocoles mais selon le matériel à disposition, chaque protocole nécessite des optimisations qui vont l'adapter au matériel. Pour mes transformations chez E. coli BL21(DE3) il me fallait 100 ng de plasmide issu de la ligation pour avoir un nombre de colonies transformées correct. Chez d'autres bactéries comme E. coli DH5 alpha, avec 10 ng de plasmide on a un nombre de colonie énorme sur boite. Donc faire preuve de retenue lorsque l'on n'est pas d'accord avec un protocole fonctionnant pour quelqu'un d'autre me parait judicieux.

Greg

[invite2b117f7b]

Merci à tous pour vos réponses.

bonsoir,
- un dépôt sur gel ne servira a rien, puisque c'est une mutagenese et non pas une amplification. 50 ng = non visible sur gel.
proposition:
- augmenter le tps de denaturation jusqu'a 5 min 95C. les oligos auront du mal a se fixer si la denaturation n'est pas suffisante.
- 1h de dpnI suffit = gain de temps.
- mais 1ul ne suffit pas pr une transfo, normalement j''utilise 10ul de ma mutagenese.
- regeneration ne sert a rien tant que l'antibio est de l'ampi = ne bloque pas la traduction = gain de tps.
- a la fin, vs dtes aucune culture = aucun clone sur boite puisque la transfo vs l'etalez sur boite LBA?

Après transfo on étale sur LBA pour pouvoir selectionner les colonies qui expriment le plasmide muté. Et non je n'obtiens aucune culture.

[invite6d14e0f5]

bonsoir,
je suis tout a fait d'accord avec vous ds le sens ou pr tous mutants (ou type de cellules comme ds votre cas), le protocole nécessite une optimisation.
Je trouve votre remarque déplacé,
''Donc faire preuve de retenue lorsque l'on n'est pas d'accord avec un protocole fonctionnant pour quelqu'un d'autre me parait judicieux'', puisque Sha_a avait bien commencé par ''j'ai un petit problème et j'aimerai avoir votre aide'' - problèmes de mutagenese.

Pr ce qui est des c. E. coli BL21(DE3), il vs fallait 100 ng de plasmide, car ce type de cellule est utilisé pr la production de protéines recombinantes. Le taux (%) de transformation de ces c. est plus faible que celui des DH5 alpha, utilisées le 3/4 pr un clonage (et parfois même pr une production).

[invite71f23525]

Ce n'était pas les réponses que tu avais faite à Sha_a que je reprochais mais celles à Flyingbike que tu contredisais plutôt abruptement (toutefois, je ne suis pas allé jusqu'à écrire en vert). En revanche, je ne remets pas en cause le fond de tes réponses. Mon exemple sur les deux types de bactéries ne faisait qu'illustrer les différences que l'on peut observer d'un matériel biologique à l'autre.

Cordialement,

Greg

[invite6d14e0f5]

bonjour,

je m'étais pas rendu compte que ce n'était pas Sha_a
Tout s'explique

Si non, est-ce que vous pouvez me renseigner sur GelRed. Est-ce qu'il est plus efficace que le Bet? comment ca marche?

[Flyingbike]

Le GelRed c'est aussi un intercalant mais qui est plus sensible que le BET. Il résiste a la chaleur (possibilité de faire fondre un gel contenant du GelRed sans altérer sa fluorescence) et on peut se débarasser des tampons et gels dans des poubelles normales vu qu'il n'est pas toxique. C'est un peu plus cher par contre...