Bonjour à tous, j'ai une petite question concernant la PCR:
Notre prof nous a dit que lors d'une réaction de PCR, on amplifiait indifferemment l'allèle paternel, ou l'allèle maternel, mais dans ce cas il ne faut pas mettre 2 mais bien 4 amorces non?
La séquence de chaque allèle (paternel et maternel pour le même gène) est bien différente?
pas forcément, ca dépend surtout de la région amplifiée qui elle même dépend des amorces...
Donc pour la PCR on utilise (pour les amorces) des séquences similaires, qu'elle soit paternel ou maternel?
ca dépend du but de la PCR... Tu parles de quoi ?
Je suis vraiment débutant (1ere année de médecine) donc on m'a juste appris, la technique classique de PCR. On a ensuite vue le séquencage et là notre prof nous a dit que souvent on utilisait des produits de PCR pour le séquencage et donc dans les résultats (de l'électrophorèse couplée à de la fluorescence), on pouvait trouver deux piques (l'un correspondant à l'allèle paternel et l'autre à l'allèle maternel) justement parceque le pruduit de PCR était composé indifféremment d'allèle paternel et maternel...
Moi je pensai qu'on ne mettait qu'un "chromosome" avant l'amplification et donc qu'un seul des deux allèles.
C'est pour ça qu'en ce qui concerne les amorces (l'allèle paternel et maternel étant différents) je pensait qu'il en fallait deux différentes (donc 4 car 2 de chaque)...
Je suis désolé mais explications ne sont pas très clair et je suis un peu confus.
AH d'accord. En fait le séquencage est une PCR un peu spéciale. En gros tu mets de l'ADN d'un individu (donc aussi bien les alleles maternels que paternels) dans ton tube avec les réactifs classiques de PCR (dont les ddNTP pour le séquencage) avec une seule amorce capable de s'hybrider avec l'ADN que tu veux séquencer (plus exactement a proximité de la séquence que tu veux obtenir). Donc au final, sur l'electrophorese, tu as les résultats de l'élongation obtenue a partir de cette amorce. Meme si les amorces s'hybrident au même endroit sur les séquences paternelles et maternelles, il se peut que tu amplifies une région qui diffère : sur l'electrophorégramme tu auras la superposition des deux signaux.
Donc pour la PCR aussi on amplifie indifféremment l'allèle paternel ou maternel, et l'amorce correspond a une région homologue sur les 2?
ET d'ailleur la formule qui nous donne la quantité théorique final 2^n - 2n, est fausse, car si on a l'allèle paternel et maternel dans notre tube, on a bien 4 brins différents, ce qui nous donnerait alors théoriquement 4^n-2*4*n quantité d'adn finale...
Envoyé par yann782
Je pense qu'il parlait de l'établissement d'un profil génétique. En fait il s'agit de réaliser une PCR sur des marqueurs micro-satellites. Ces marqueurs sont des petites séquences (2 à 10 paires de bases) répétées en tandem. Ce qui varie n'est pas la qualité des nucléotides (bien qu'ils peuvent avoir quelques modifications) mais la quantité de répétitions. On réalise donc une PCR avec des amorces marquées (fluorescence) que l'on fait migrer en capillaire sur un séquenceur. On obtiens ainsi la taille de chaque allèle (à une base près) d'où les deux pics.
Sachant que les régions flanquants les séquences microsatellites sont identiques chez le père et la mère donc les amorces ne sont pas différentes.
Merci beaucoup de vos réponses rapides!! Et donc la qauntité de produit de PCR s'obtient toujours avec la formules 2^n - 2n?
Pour moi, Cn=Co*E^n
où E est l'efficacité de la PCR (au max = 2)
