Promoteur banque BAC

[invitec19a72c7]

bonjour,


J'aurai une petite question à vous soumettre.

J'aimerai globalement connaitre la démarche pour récupérer une séquence promotrice d'une banque BAC pour ensuite le cloner dans un vecteur rapporteur et étudier ce promoteur.


merci
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[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur. Après la PCR, tu clives l'insert avec la ou les enzymes de restriction appropriées, idem pour le vecteur. Puis ligation insert/vecteur.

Pour le choix du vecteur, peut-être il existe des constructions dédiées à ce genre d'approche mais je n'en connais pas.

Greg

[invitec19a72c7]

Merci, mais il faut d'abord cribler les clones de la banques qui contiennent ma séquence promotrice non?

Pour cela comment cela fonctionne et comment puis je être sur que les clones contiennent ma séquence promotrice complète?

merci

[invitec19a72c7]

Personne pour m'aider??

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite71f23525]

Sous quelle forme est ta banque?

Si elle est sur gélose, tu fait une réplique sur membrane de nitrocellulose c'est à dire que tu découpes une membrane de nitrocellulose de la taille de la gélose, tu la déposes sur la gélose de manière à ce que les colonies fasse bien contact avec la réplique. Ainsi tu as des bactéries sur la membrane de nitrocellulose. Ensuite, tu réalise une hybridation de sondes chaudes spécifiques de ton promoteur, tu révèles en autoradiographie et tu vois quelles colonies sont marquées. Pour être sûr que ton promoteur est entier, tu peux éventuellement faire deux répliques. Sur chacune tu mets une sonde différente : pour une réplique une sonde hybridant juste en amont de la partie qui t'intéresse, pour l'autre réplique une sonde hybridant juste en aval de ton promoteur. Les colonies marquées par les deux sondes contiennent le promoteur entier.

Je n'ai toujours vu cette méthode qu'en théorie, je ne la connais pas en pratique. Par exemple, je ne crois pas qu'il y ait besoin de lyser les bactéries sur la réplique. Il doit y avoir suffisamment d'ADN provenant de bactéries lysées spontanément au sein de chaque colonie répliquées sur la nitrocellulose pour être détecté par les sondes. Tu peux toujours te renseigner sur les détails de cette méthode de criblage sur le net... je suis allé rapidement sur Protocols Online mais je ne l'ai pas trouvé...En cherchant un peu plus, ça doit pouvoir se trouver.

Greg

Greg