Expression stable: perte du transgène

[invite980816fe]

Bonjour à tous,
j'essaie de produire des lignées stables en les transfectant (via liposomes) avec un vecteur plasmidique portant un gène de résistance (sélection au G418) et gène rapporteur (beta galactosidase). Les lignées (293 et CHO) présentent une bonne expression transitoire à 48h, mais quand je passe à la sélection au G418, les 293 meurent en une semaine et pour ce qui est des CHO j'obtiens des clones résistants au G418 (à partir de trois semaines et plus) mais qui n'expriment pas beta gal. Je précise que j'ai bien linéarisé le plasmide en dehors des séquences "résistance et rapporteur" avant la transfection. Comme c'est la première fois que je tente ce genre d'expérience, je ne sais trop comment améliorer la chose: intégration du gène de résistance ET du gène rapporteur (puisqu'il semblerait que je le perde). Quelqu'un a-t-il une idée ?
Merci d'avance.
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[invite71f23525]

L'intégration d'un transgène dans le génome se fait par recombinaison homologue. Cela nécessite la présence, de part et d'autre de la région du plasmide à intégrer, de séquences présentant une homologie forte avec la zone du génome dans laquelle on souhaite l'intégrer.

Si ton gène de résistance s'intègre et pas ton transgène, c'est certainement un problème au niveau des séquences homologues qui permettent l'intégration de ces gènes.

Il me semble qu'habituellement on intègre le gène de résistance et le transgène au niveau du même site, c'est à dire que les séquences homologues sont placées de part et d'autre du gène de résistance et du transgène accolés : séquence homologue 5' - gène de résistance - transgène - séquence homologue 3', pour faire simple. Renseignes-toi donc sur l'organisation de ton plasmide.

Tes problèmes proviennent certainement, pour les cellules CHO, de la présence d'une séquence homologue entre le gène de résistance et le transgène, excluant ainsi le transgène de l'intégration dans le génome de hamster. Pour les cellules 293, pas de séquences suffisamment homologues à une région du génome humain pour permettre l'intégration de ton matériel génétique. Pour en être sûr, blastes la séquence de ton plasmide contre une banque génomique de hamster et humaine respectivement.

Greg

[invite980816fe]

Bonjour à tous,
Merci pour cette première réponse, mais je ne suis pas vraiment convaincue. Je m'explique:
Je pratique la recombinaison homologue avec d'autres types d'organismes (viraux, bactériens...) et je connais la nécessité d'avoir des séquences homologues pour ce faire... Mais pour la création de lignées stables, lorsque l'on regarde bien les vecteurs commerciaux proposés pour ce type d'expérimentation (type pcDNA3.1 par ex.) il ne présentent pas particulièrement de séquences choisies à l'avance pour présenter des homologies avec telle ou telle lignée (d'ailleurs ces plasmides sont en théorie valables pour tout type de lignée, la pratique montrant par la suite une efficacité relative...). Mon plasmide est construit de manière équivalente, pourquoi donc en irait-il différemment ? Et je repose donc la question, n'y aurait-il pas une manière d'améliorer l'efficacité de la manip (cycle cellulaire, linéarisation du vecteur différente, etc...). Quelqu'un aurait-il eu des déboires de ce type et aurait-il trouvé une solution à ce problème avant moi ?
Merci par avance pour vos idées...

[invite71f23525]

J'ai jamais compris comment on pouvait se permettre de faire des transfections stables avec autant de hasard. Pour la création de KO sur cellules ES, on choisit des séquences flanquantes du fragment à insérer bien précises de la région où on veut l'intégrer, et c'est d'ailleurs ce qui permet à un KO d'être ciblé et efficace. Pourquoi ne pas faire la même chose pour les transfections stables, où je le rappelle, l'intégration au hasard peut avoir des conséquences fâcheuses comme l'inactivation d'un gène, donnant ainsi un phénotype hasardeux, tout comme les résultats qui suivront....Donc désolé d'être à contre-courant, mais je trouve cette façon de faire impertinente.

Greg

Edit : en tout cas, si ta transfection stable marche, surtout, pense à faire une vérification de la zone où s'est intégré ta construction pour t'assurer de la validité des résultats par la suite....

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut

On ne peut pas faire cela simplement en stable car les cellules de mammiferes ne font que tres peu de recombinaison homologues. Tu es obligé de forcer le systeme en creant des cassures double brin sur le chromosome pour forcer l'intégration.

YOyo