[biologie moléculaire] Probleme expression apres transfection stable

[invite6e272aa1]

Bonjour!
J'ai réalisé une construction en vue de l'expression d'une protéine en stable par des cellules HeLa. Le vecteur utilisé est le pIREShyg3, qui comme son nom l'indique contient:
-un gêne de résistance à l'hygromycine pour la sélection
-un site IRES: le gêne d'intérêt et le gêne de résistance sont exprimés sur 1 seul ARN, le site IRES au milieu permet l'entrée d'un ribosome, et la traduction à coup sûr des deux gênes. Comme ça normalement, le gêne de résistance n'est pas plus exprimé que l'autre et vice versa.... Normalement...
La construction a bien marché, le séquençage est OK, les cellules transfectées résistent à l'hygromycine (pas les cellules non transfectées contrôle), mais pas de trace de notre protéine, rien ; alors que l'expression est importante avec un vecteur pCMV en transitoire.
Mais que se passe-t-il? Qu'est ce que j'ai mal fait?
Merci de votre aide!
-----

[invite85934679]

Salut,
J'ai eu le même problème avec des stables (C2C12, cellules de souris) --> Résistance exprimée mais quasiment pas de prot exogène, alors que no problem en transitoire! J'en ai déduis que ça venait du fait que la prot qu'on a cloné soit importante pour la cellule, et que le fait de la surexprimer pouvait avoir un effet négatif sur les cellules, et du fait la sélection favorisait les cellules exprimant peu. Finalement, je suis en train de voir d'autres alternative : l'électroporation ou un vecteur viral pour une transfection transitoire très importante.

Quelle protéine essaye tu de surexprimer ??

[invite7031d308]

bonjour.
Quel est le sens de l'IRES? la résistance à l'hygro est avant ou après l'IRES ?
En cas de transfection transitoire, le plasmide n'a as besoin de s'intégrer.
En cas de sélection, il faut nécessairemenet une ouverture du pasmide qui peut se faire n'importe ou.
En ceas de production de protéine par un vecteur IRES, il faut établir des clones cellulaires.