Mutagénèse dirigée

[invitee2211ec4]

Bonjour,

Je suis étudiante en M2 et je suis en train d'essayer de faire une mutagénèse dirigée sur un plasmide de 11kb. Pour cela j'utilise un kit approprié pour ce genre de cas , "Quikchange XL Site-directed mutagenesis kit" de stratagene.

Dans ce kit le contrôle positif de la mutagénèse utilise un plasmide Whitescript de 4,5 kb. Après la mutagénèse et la digestion des produits par l'enzyme Dpn1, je fait un gel de 0,8% agarose pour vérifier avant la transformation si ma mutagénèse à marché.....Seulement là j'ai un petit soucis parce que dans mon contrôle (plasmide whitescript) et dans mon echantillon, tout ce que je dépose sur mon gel reste dans le puit...(je dépose 5µl de produit de PCR)

Est ce que quelqu un a déjà eu ce problème et saurait peut être à quoi il est dû?

Merci d'avance pour toute aide!!
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[invite853321bf]

T'utilises quoi comme tampon de migration ?

[invitee2211ec4]

J' utilise du TBE 0,5%.

[Flyingbike]

tu déposes un marqueur de taille avec ? il reste aussi dans le puits ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite853321bf]

et tu utilises un tampon de charge?

[invitee2211ec4]

Oui je dépose un marqueur de taille qui migre normalement et comme tampon de charge j'utilise du bleu de bromophenol (avec glycerol et EDTA).