Extraction ARN plaquettaire

[invited88ad1fd]

Bonjour à tous,

Je travaille actuellement sur les plaquettes et aimerais réaliser une RT-PCR pour étudier un niveau d'expression. Je me heurte cependant à un problème de taille à savoir la quantité d'ARN présent dans ces dernières. Il s'agit en effet d'un ARN vestigial dont la quantité est estimée d'après les publi à environ 12000 fois moins que chez un leucocyte.
J'ai essayé d'extraire de l'ARN des plaquettes issues de 70 ml de sang par le kit Qiagen RNeasy mais n'atteint que difficilement les 3ng/µL ce qui me semble bien peu pour la rétrotranscription ultérieure... Quelqu'un aurait-il une expérience dans ce domaine pouvant m'aider ?

Merci, bonne journée
Kurisu
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[Flyingbike]

as tu essayé une extraction guanidium puis phénol/chloroforme ?
3ng/µL c'est comme si c'était de la flotte...

[invited88ad1fd]

Bonjour,

Merci pour ta réponse. Non je n'ai pas essayé d'autres méthodes pour l'instant, je vais étudier la solution du phénol/chloroforme. Tu penses qu'elle a de meilleurs rendements que les kits commerciaux ?

Kurisu

[invite98ab1ae6]

Salut!
Je ne travaille pas vraiment sur l'ARN sur le moment, mais la question m'avait interessee (je suis curieuse). Du coup j'avais regarde un peu, et j'ai trouve ca. Ils amplifiemt aussi peu que 0.02ng d'ARN... Je ne sais pas ce que ca vaut, mais jette un coup d'oeil.

Bon courage!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite853321bf]

Oui le phénol chloroforme a toujours de meilleurs rendements principalement à cause des élutions dans les kits. Les colonnes ont un pouvoir limité de rétention des acides nucléiques. Donc ils en retiendront une quantité x et leur reste passera.
L'extraction phénol chlo repose sur des séparations de phase entre phénol et eau. Dans ce cas les déperditions se font surtout à cause du pipetage. Le but du jeu est de récupérer la phase supérieure au maximum sans prendre l'interface. Donc on en laisse toujours un peu et plus le milieu est complexe, plus il faudra de lavage, mais la quantité récupérée reste quand même largement supérieure. Mais c'est plus long, contraignant et plus aléatoire sur les quantités récupérées