Extraction ADN sur gel d'agarose et seconde PCR

[invite364d48af]

Bonjour,

je dois séquencer un génome mitochondrial mais je suis bloquée sur un problème de spécificité de mes amorces qui ne sont pas de la même espèce que mon modèle. Bref pour l'instant il n'est pas question de cloner (ce qui aurait été bien plus rapide!) mais de faire des PCR en prenant exemple sur le modèle publié, de les séquencer puis de voir si on s'y retrouve...

Bien sur, lorsque je réalise ces PCR avec les amorces publiées j'ai de nombreuses bandes non spécifiques et donc je découpe mes bandes d'intérêt sur gel d'agarose puis les passent sur le Nucleo Spin extract II , je vérifie sur un 2nd gel que j'ai bien une bande unique à la taille attendue (ça c'est ok) pour chaque couple de primers et je refait une PCR pour avoir plus de matériel.(lorsque j'essaie de séquencer directement mes séquences sont moches)

Au départ, cette seconde PCR ne fonctionnait pas car je mettait trop de produits de PCR (1µl à 10 à 20ng pour un volume final de 25µl) donc j'obtenais de très beaux smear!!!
Bref j'ai dilué au 1/1000 mes produits de PCR , et là pour certains échantillons c'est ok alors que pour d'autres je me retrouve avec 2 bandes plus petites (ex 500 et 600 bp au lieu de ma bande unique vers 1200bp!) que se passe-t-il ????
De plus pour d'autres échantillons je ne voit pas de bandes (mais j'essaierai de séquencer quand même pour voir ce que cela donne, parfois cela fonctionne bien quand même)

Si certaines personnes ont déjà fait ce genre de manips je suis preneuse de tous vos conseils

Merci et bonne journée
-----

[piwi]

Je me suis déjà amusé à cela avec le même kit que vous et ça n'a jamais bien marché non plus (si ca peut vous rassurer d'une certaine manière)
L'extraction de bande sur gel est quand même une entreprise assez pourrie.

Bon courage.

[invite98ab1ae6]

Ah?
Dans un des labos ou je suis passee, on le faisait de maniere tres "artisanale".
On percait un trou en bas d'un tube 0.5 ml, y mettaient un peu de cotton sterile, le bout d'agarose avec la bande decoupee, mettaient le tout dans tube 1.5, centri, et le tour etait joue. Il me semble que c'etait assez clean pour refaire une PCR derriere, mais je crois qu'on diluait l'extrait avant.
Pour nous ca marchait au moins aussi bien que le kit, mais c'etait surtout pour le cout (la joie de certains labos en France).
Je ne savais pas qu'il y avait des problemes de re-amplification apres extraction d'un gel, j'en ai jamais rencontre moi-meme, en tout cas.
Tu penses que c'est du au rendement ou aux inhibiteurs, Piwi?

[invite364d48af]

ce qui me surprend vraiment c'est qu'après extraction et passage sur la membrane de NucleoSpin j'ai sur le gel d'agarose de très belles bandes et q'après avec les mêmes conditions de PCR j'ai des bandes beaucoup plus petites?
il ne vous aura pas échappé que 500+600 égal 1100 ce qui correspond à la bande attendue ou du moins découpée!
Bref je retente une PCR dans des conditions différentes de Tm et d'élongation mais bon je ne crois pas pouvoir améliorer la chose...
Si j'ai du nouveau je ne manquerai pas de venir vous en faire part!

Merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite364d48af]

Par rapport au kit j'ai des collègues qui travaillent avec mais ils font ensuite du clonage et il n'ont pas de problème; moi j'ai déjà le soucis de partir d'amorces non spécifiques!

[invite98939c3f]

Bonjour,

des nouvelles de ton problème?
car je rencontre les mêmes en ce moment... je découpe des bandes entre 1000 et 2000pb et kit + seconde PCR... mes fragments amplifiés sont d'environ 500pb (plus ou moins)...

merci

[inviteef0070f1]

Une question rien a voir: Vous etes étudiants? si oui vous faites ces manip en quelle année? ca a l'air chouette

[invite853321bf]

Tu commences à faire des manips par toi même dans les labos en bac+4.
Sinon suivant les facs tu en fais aussi durant les TP, mais ça n'a pas la même saveur

[invite98939c3f]

Tu commences à faire des manips par toi même dans les labos en bac+4.
Sinon suivant les facs tu en fais aussi durant les TP, mais ça n'a pas la même saveur

tu peux aussi en faire si tu le souhaite lors de tes vacances scolaires (généralement après la L3, pendant 2 3 mois) mais vu le temps court tu n'as pas le temps de vraiment manipuler mais ça donne un bon aperçu.
Sinon, moi je suis en M2 à paris 7.

[invite71f23525]

Pourrait-on arrêter le hors-sujet svp?

Merci.

LXR pour la modération

[invitecf0f3574]

Vous devriez esayer une "nested PCR", pour moi ca marche mieu que decouper du gel et c'est plus rapide.
voici une breve description de ce que c'est:
http://en.wikipedia.org/wiki/Nested_...chain_reaction
http://www.chups.jussieu.fr/polys/bi....Chp.8.11.html

[invite98939c3f]

Bonjour,

merci pour ta réponse.
Cependant dans mon cas, je ne peux pas avoir 2 couples de primers.
Je cherche à identifier des gènes avec des primers dessinés sur un autre gène... je ne sais pas où sont insérés les gènes que j'amplifie...

Mais cependant, quand tu fais cette technique, tu ne fais pas de purification sur gel pour récupérer ton produit? (ou une purification de PCR?)

[invitecf0f3574]

Bonjour,
Mais cependant, quand tu fais cette technique, tu ne fais pas de purification sur gel pour récupérer ton produit? (ou une purification de PCR?)

non je PCR directement ma premiere PCR.

[invite98939c3f]

je voulais savoir après ta seconde PCR en fait

[invitecf0f3574]

et bien ca dépend. Normalement oui tu dois purifier tu peux tenter des les envoyer non purifier mais tu as un risque que les séquences soient "polluées'

[invitee863e61a]

La réponse est soit dans la façon très précise dont tu manipules ou alors un problème du kit.
Quand tu découpes ton fragment, essaie de minimiser l'impact des UV (exposition réduite, aluminium sous le gel, etc.). Par ailleurs tu devrais procéder en PCR nichée (la PCR IIaire se fait avec des oligos en aval de la première plutôt qu'avec les mêmes oligos), cela fonctionne mieux. Enfin, je te conseille le kit Wizard de Promega

[invite98939c3f]

bonjour,
merci pour ta réponse Jmbowie.
Je ne pense pas que cela provienne de ma manip en elle-même.. on est plusieurs au labo qui obtenons ce problème de bandes amplifiées à la taille voulue et après une seconde PCR un produit d'amplification beaucoup plus petit.
Je ne vois pas du tout ce qu'il peut se passer au niveau "moléculaire" pour obtenir ces résultats et pourquoi une PCR ayant fonctionné bien la première fois "ne refonctionne plus"...(dans exactement les mêmes conditions)

[gorben]

Perso je suis d'accord avec les autres. Ce genre de chose doit se faire en PCR nichee sinon tu amplifies n'importe quoi.

Sinon tu ne peux pas sequencer directement tout le genome par solexa? C'est pas super cher maintenant, surtout pour un si petit genome et au moins tu auras toutes tes infos.

a+

[invitee863e61a]

Puisque l'objectif initial était d'avoir plus de produit de PCR, je suggère de la faire en plusieurs fois et des les pooler au moment de la purification. Bon courage

[invite98939c3f]

Bonjour,

merci pour toute vos réponses! suite à une PCR j'ai enfin eu une quantité suffisante d'ADN pour continuer.
Je pouvais vraiment pas faire de PCR nicher... je pars d'un organisme non séquencé, et de primers dessinés à partir de gènes d'autres espèces pour tenter d'identifier de nouveaux gènes. Donc oui, j'amplifie du n'importe quoi et j'espère quelques séquences d'intérêts, le tout que j'introduis dans un vecteur et séquençage...pour voir s'il y a qqch d'intéressant

merci en tout cas!

[gorben]

Salut,

Bonjour,

merci pour toute vos réponses! suite à une PCR j'ai enfin eu une quantité suffisante d'ADN pour continuer.
Je pouvais vraiment pas faire de PCR nicher... je pars d'un organisme non séquencé, et de primers dessinés à partir de gènes d'autres espèces pour tenter d'identifier de nouveaux gènes. Donc oui, j'amplifie du n'importe quoi et j'espère quelques séquences d'intérêts, le tout que j'introduis dans un vecteur et séquençage...pour voir s'il y a qqch d'intéressant

merci en tout cas!

Je vois pas en quoi ca t'empeche de redesigner tes primers pour faire une PCR nichee...

[invite98939c3f]

Perso je suis d'accord avec les autres. Ce genre de chose doit se faire en PCR nichee sinon tu amplifies n'importe quoi.

Sinon tu ne peux pas sequencer directement tout le genome par solexa? C'est pas super cher maintenant, surtout pour un si petit genome et au moins tu auras toutes tes infos.

a+

bonjour,

si j'ai bien compri, il me faut un couple de primers "externes" et un couple de primers "interne"...
problème: je ne sais pas ce qu'il y a autour de mes gènes donc je dessine mes primers sur mes gènes, la séquence permettant l'obtention d'un bout "collant" pour une enzyme+début de la séquence codante avec l'ATG ou la fin... donc si après je dois prendre un autre couple de primers, ce serait "plus loin" dans mon gène et je perdrais le début de celui-ci.. or, on veut le gène en dans sa totalité...
je ne vois pas comment je pourrais faire

[gorben]

bonjour,

si j'ai bien compri, il me faut un couple de primers "externes" et un couple de primers "interne"...
problème: je ne sais pas ce qu'il y a autour de mes gènes donc je dessine mes primers sur mes gènes, la séquence permettant l'obtention d'un bout "collant" pour une enzyme+début de la séquence codante avec l'ATG ou la fin... donc si après je dois prendre un autre couple de primers, ce serait "plus loin" dans mon gène et je perdrais le début de celui-ci.. or, on veut le gène en dans sa totalité...
je ne vois pas comment je pourrais faire

Voila grosso-modo un principe. Comme dans ta deuxieme PCR tes amorces sont specifiques, ton rendement sera nettement plus grand.

Ce n'est qu'une solution, mais tu peux imaginer d'autres design de primer.

[gorben]

Desole, le schema est faux, j'avais mal lu ton probleme. Le principe reste par contre correct. Il suffit de faire des amorces la ou tu veux.

[invite98939c3f]

Desole, le schema est faux, j'avais mal lu ton probleme. Le principe reste par contre correct. Il suffit de faire des amorces la ou tu veux.

merci beaucoup