Western blot : quelle unité ?

[invite4f80dcbf]

Bonjour,

Voici un western blot. Avez-vous une idée de ce que peut être l'unité en ordonnées ("Mt(K)") ? C'est apparemment un temps de migration, mais j'ignore à quoi peut bien faire référence le K.



Merci
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[invite71f23525]

Hormis le fait que le western soit d'une médiocrité rare, je pense que M est l'équivalent de MW donc la masse molaire, et K entre parenthèse veut probablement dire KDa. C'est à dire que les chiffres en-dessous sont la masse molaire des protéines exprimée en KDa. Le petit t à côté du M, je ne sais pas ce qu'il veut dire. J'ai déjà vu ce genre de résultat catastrophique, avec des notations qui ne sont pas usuelles dans des revues de basse qualité comme Biochemistry (Moscow).

Greg

[invite4f80dcbf]

Merci pour ta réponse!

Ce western blot, apparemment dur à réaliser, est l'un de ceux d'un article paru dans Nature Cell Biology (mai 2008).

[invite71f23525]

Merci pour ta réponse!

Ce western blot, apparemment dur à réaliser, est l'un de ceux d'un article paru dans Nature Cell Biology (mai 2008).

As-tu une explication par rapport à ce que j'ai mis en gras dans la citation? Si cela a été publié dans une revue aussi prestigieuse, extrêmement pointilleuse sur la qualité des manips, je suppose que ta remarque est fondée. J'ai déjà vu des ubiquitination assay, souvent d'ailleurs ils marquent l'ubiquitine avec HA et après immunoprécipitation ils font un western anti-HA il me semble. Le smear observé est courant mais je dois dire que là il est particulièrement moche...

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite4f80dcbf]

La protéine exprimée "is notoriously difficult to express".

Pourquoi, je n'en sais rien!

[invite4f80dcbf]

Quelque chose m'étonne dans ces manips d'ailleurs...
Il est question de His purification (la protéine en question ayant été marqué avec 6 histidine) puis d'IP (immunoprécipitation) + His purification.

Dans les deux cas, des anticorps sont utilisés.

Je ne vois pas ce qu'apporte l'IP.

Merci!

[invite71f23525]

Ce qui aiderait beaucoup c'est que tu postes un lien vers l'abstract NCBI de ton article.

Sinon, je suppose qu'ils font une IP anti-His pour ne regarder l'ubiquitination que de leur protéine taggée. De très nombreuses protéines sont ubiquitinées dans la cellule, un blot anti-Ub donnerait donc un profil général n'apportant rien.

Greg

[invite4f80dcbf]

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18408733

[invite71f23525]

Je le regarderais plus tard. Malgré que ce western ne soit pas beau, il est tout de même interprétable : la protéine est ubiquitinée au bout de 20 minutes et cette ubiquitination perdure au cours du temps, ce qui veut dire, si ces temps sont sur cellules, que l'ubiquitination en question n'est pas de type à adresser au protéasome (K48) et que l'ubiquitination est stable (non réversée par des déubiquitinases). Sinon on aurait observé une disparition du smear correspondant.

Greg

[invitec9f0f895]

Salut

Vu la taille des signaux (200kDa a vu de nez)ca ne m'etonne pas que ca soit une manip compliquée! j'ai deja vu ce genre de resultats sur des western réalisés a partir de gels d'agaroses (pour les tres grand complexes).

Yoyo

[invite71f23525]

200 kDa ce n'est pas non plus énorme en western blot. J'ai travaillé un an sur une protéine de 250 kDa avec un bon anticorps les westerns étaient jolis avec un protocole standard. Je pense que ce problème de smear lors des ubiquitination assay viennent de l'ubiquitination qui peut être une mono-, multi- ou polyubiquitination. L'ubiquitine fait 77 acides aminés, on peut suspecter que de petites variations qualitatives quant au type d'ubiquitination de la protéine peuvent être responsables de différence de mobilité électrophorétique apparaissant sous forme de smear.

La photo du blot me fait penser à une surexposition qu'on retouche en diminuant la luminosité et en augmentant légèrement le contraste. je lirais rapidement le passage de la publication concernée.

Greg

[invitea0443c8c]

Bonjour!

Si l'on regarde la légende du papier, tout est clairement expliqué. Il s'agit d'une purification en time course de la protéine PML taguée 6His, révélée avec un anti-ubiquitine. Les smear observés correspondent donc aux variations d'ubiquitination de PML au cours du time course.

Je pense que ce problème de smear lors des ubiquitination assay viennent de l'ubiquitination qui peut être une mono-, multi- ou polyubiquitination. L'ubiquitine fait 77 acides aminés, on peut suspecter que de petites variations qualitatives quant au type d'ubiquitination de la protéine peuvent être responsables de différence de mobilité électrophorétique apparaissant sous forme de smear.

On observe des smears en ubiquitination assays pour les longues chaines donc pas pour les mono, di, tri etc... L'ubiquitine fait 76 acides aminés. Le smear est observé dans les hauts poids moléculaires parce que le pouvoir séparateur du gel n'est pas assez important pour distinguer des différences de 8kDa.
Les variations qualitatives, pour reprendre ton expression, ne correspondent à rien de connu si ce n'est éventuellement aux chaines hétérotypiques (ex: K48/K27/K63...) qui ne sont observées qu'in vitro pour le moment. Mais il n'est pas possible d'identifier ces « hétérotypies » simplement en regardant le smear IB anti-Ubi.

V.

[invite4f80dcbf]

Merci pour ta réponse.

Comment réalise-t-on un "time course" ?
J'avais lu cette expérience comme s'il s'agissait d'un western blot, en parlant de polyubiquitinilation. Penses-tu que cela revienne au même ?

Merci

[invitea0443c8c]

Merci pour ta réponse.

Comment réalise-t-on un "time course" ?
J'avais lu cette expérience comme s'il s'agissait d'un western blot, en parlant de polyubiquitinilation. Penses-tu que cela revienne au même ?

Merci

C'est un western blot de poly-ubiquitination! Le time course correspond aux différentes durées de traitement des cellules à l'arsenic (Cf légende...).

V.

[invite4f80dcbf]

Merci!
(jamais mis les pieds dans un labo...)

[invitea0443c8c]

Merci!
(jamais mis les pieds dans un labo...)

Aucun problème

V.