contrôle interne pcr

[invited40409d0]

Bonjour,

Je viens de réaliser une pcr pour déterminer un seuil de détection d'un kit de salmonelle. On amplifie le gène inv A. J'ai quelques problèmes pour analyser mon gel.
On me dit que la taille de l'amplimère est de 284 bp qd la détection est positive et 157 bp qd cela est négatif (ça correspond au contrôle interne).

D'après ce que j'ai compris, on a rajouté le contrôle interne dans le mix pcr, donc la bande de 157 bp doit toujours être présente pour toutes les concentrations testées. J'ai bien compris ?

Dans la colonne du contrôle négatif, je n'ai que la bande du contrôle interne de 157 bp puisque le contrôle négatif est fait avec de l'eau et ce n'est pas amplifié. Est ce cela ?

Dans la colonne du contrôle positif, j'ai deux bandes ; celle du contrôle interne (157 bp) et celle du contrôle positif(284 bp ???). C'est là que je comprends pas bien, est ce que le gène (inv A) des salmonnelles a la même taille que la séquence de l'adn du contrôle positif reconnue par les primers ?
Car pour que la portion d'ADN recherchée soit amplifiée, il faut que ses extrémités soient complémentaires des primers. La bande de l'adn du contrôle positif doit être au même niveau que celle représentant le gène recherché sur le gel ?

Pour finir, on me demande en quoi la concentration du contrôle interne influence la valeur du seuil de détection. La je n'ai aucune idée.

merci d'avance pour votre réponse
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[piwi]

Le contrôle interne correspond en général à de l'ADN que l'on ajoute au mix PCR afin de vérifier que la PCR a bien fonctionné même quand le résultat est négatif.

Ainsi, si vous ne mettez que de l'eau (contrôle négatif), vous n'aurez que l'ADN présent dans le mix et vous n'amplifiez que lui (157 pb).
Si votre échantillon est négatif, rebelotte. Mais vous pouvez discriminer entre:
ma PCR n'a pas marché (aucune bande)
ma PCR est négative (une seule bande à 157 pb)

Cordialement,
piwi

[invited40409d0]

merci pour votre réponse, donc si j'ai bien compris plus je met d'étalon interne dans mon mix, plus il va être amplifié et la bande le représantant va être plus épaisse. Est il possible que si l'on met trop d'étalon interne dans le mix pcr, on ne détecte plus le gène invA car sa bande sera 'cachée' par celle de l'étalon interne ? On aura donc une erreur de lecture pour déterminer le seuil de détection du kit ?

[invite853321bf]

merci pour votre réponse, donc si j'ai bien compris plus je met d'étalon interne dans mon mix, plus il va être amplifié et la bande le représantant va être plus épaisse.

Oui et non, à un moment vous allez atteindre un plateau car un des réactifs de votre mix sera épuisé. Si vous mettez plus d'ADN au départ, vous atteindrez plus rapidement votre plateau c'est tout. Reste donc à savoir si vous atteignez ce plateau ou non à la fin de votre PCR

Est il possible que si l'on met trop d'étalon interne dans le mix pcr, on ne détecte plus le gène invA car sa bande sera 'cachée' par celle de l'étalon interne ? On aura donc une erreur de lecture pour déterminer le seuil de détection du kit ?

Théoriquement, oui. On en revient à un problème de stats, les amorces puis la Taq auront plus de chance de s'hybrider puis d'amplifer votre témoin interne que votre séquence d'intérêt. Et suivant le principe de la PCR, cela ne va pas en s'arrangeant Mais l'inverse est aussi vrai.

Pour ce qui est de la taille du témoin positif, je pense que oui, il est là aussi pour vous aider dans votre migration.

[A voir en vidéo sur Futura]